ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ......................................................... 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...............................................6
1.1. Биотестирование объектов ветеринарно-санитарного и экологического контроля..........................................................6
1.2. Использование методов генной диагностики для индикации и идентификации микроорганизмов.......................................13
1.3. Приборное обеспечение методов биотестирования и определения микробной контаминации..............................................31
2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................43
2.1. Цель и задачи исследований.....................................43
2.2. Объекты и методы исследований..................................43
2.2.1. Методы биотестирования основанные на регистрации поведенческой (хемотоксической) реакции инфузорий '...............................43
2.2.2. Метод определения скорости хемотаксиса инфузорий после их предварительной инкубации с исследуемым веществом...................44
2.2.3. Комбинированный метод биотестировапия........................45
2.2.4. Упрощенный метод биотестирования.............................45
2.2.5. Методы определения безопасности по выживаемости и ростовой реакции........................................................... 46
2.2.6. Методика бактериологического анализа.........................47
2.2.7. Контаминация проб микроорганизмами...........................49
2.2.8. Мечение тритием бактериальных ДНК методом «ник-трансляции» ...49 2.2.9 Мечение биотином ДНК методом «ник-трансляции».................50
2.2.10. Мечение ДНК методом «рассеянной» затравки...................51
2.2.11. Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции............................................................ 52
2.2.12. ДНК -гибридизация на мембранных фильтров с ДНК-зондами меченными тритием...................................................54
3
2.2.13. Точечная гибридизация на мембранных фильтрах с ДНК - зондами меченными биотином....................................................55
2.2.14. ДНК-гибридизация с использованием тест-набора с ДНК-зондами меченными биотином....................................................56
2.2.15. Методика полимеразной цепной реакции..........................61
2.2.16. Статистическая обработка результатов..........................61
2.3. Результаты исследований..........................................62
2.3.1. Разработка и модификация автоматизированных систем оценки безопасности объектов ветеринарно-санитарного контроля................62
0 7 11 Г)/» »% »4 Г* ^ «V % 0 /Ч г»* Г Д% Л »4/ /-Ч* * /-Ч-** /Л 1 0
1 а.>рал->их.г\<л И ошдлунКацпл аоIима 1 п^прОоапп01л иЬч/ 1ч»т
биотестирования.......................................................62
2.3.1.2. Модификации методического и программного обеспечения автоматизированных систем индикации и идентификации микроорганизмов на основе генной диагностики..........................................74
2.3.2. Приборная реализация методов определения безопасности объектов
ветеринарно-санитарного контроля в полевых условиях...................74
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................................91
ВЫВОДЫ................................................................98
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ..............................................99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................100
ПРИЛОЖЕНИЯ...........................................................123
11
Наиболее распространены при токсико-биологичсском анализе инфузории. Преимуществом инфузорий является то, что они хотя и состоят из одной клетки, но представляют собой целостный организм со свойственными ему проявлениями жизнедеятельности, во многом аналогичными таковым высших организмов.
Основными тест-реакциями, при токсико-биологическом анализе на инфузориях являются их выживаемость, рост и размножение, двигательная активность и морфологические изменения. Инфузории применяются при оценки токсичности природных и сточных вод (Айвазова Л.Е. и др., 1988, Болдырева K.M., 1988, Ульянова И.П. и др., 1988), содержащих различные токсичные вещества, в том числе соли тяжелых металлов, (Гроздов А.О. и др., 1981, Золотарева Н.И. и др., 1991, Bovie Е.С. и лр, 1977, Bovie Е.С. и др,1982); полимерных и строительных материалов (Голубкова Э.Г. и др., 1988, Семененко Э.И. и др., 1987); пестицидов (Андрющинин О.П. и др., 1988, Болдырева Н.М.,1988, Игнатьев А.Д. и др., 1978); различных лекарственных веществ (Silberstein G.B. и др., 1974); кормов и продуктов питания (Игнатьев А.Д., 1978, Курбацкая З.А., 1985, Таланов Г.А. и др., 1991).
Показано (Абилев С.К. и др., 1986), что простейшие по сравнению с водорослями обладают большей чувствительностью по сравнению с водорослями.
Наиболее распространенными тест-объектами являются парамеции и тетрахимены.
Значительное количество исследований посвящено изучению чувствительности тетрахимен к различным токсическим веществам, стероидам, антибиотикам (Blum J.J., 1972, Brizzi G. и др., 1970, Chen Mou-Liang, 1971, Dewey V.C. и др., 1978, Onada J.C. и др., 1980). Большое практическое значение имеет чувствительность тетрахимен к мутагенам и концерогенам (Jacob M.I., 1958).
12
Показана возможность комплексного анализа вод, загрязненных тяжелыми металлами и органическими соединениями (Золотарева Н.И. и др. 1991).
Результаты токсикологического анализа на тетрахименах часто коррелируют с таковыми при использовании других тесг-организмов, в том числе высших животных (Коромыслов Г.Ф. и др. 1983, Bovie E.S. 1975, Jacob M.I., 1958).
В качестве тест-объектов используются также беспозвоночные (дафнии, гидры, пиявки, моллюски), рыбы, насекомые. Однако, время проведение анализа с этими тест-объектами достаточно велико.
Наибольшее преимущество для ускоренного биотестирования имеют инфузории. Эти преимущества заключаются в следующем:
- они яапяются одновременно и клеткой и организмом, что позволяет выявлять воздействие веществ, как на клеточном, так и на организменном уровне;
- по своим основным биохимическим показателям они в большей степени, чем другие модели соответствуют высшим организмам, вследствие чего проявляют аналогичную им реакцию на воздействие токсических веществ;
- многие тест-функции соответствуют основным показателям жизнедеятельности высших животных, что повышает информативность анализа и возможность межвидовой экстраполяции полученных результатов;
- относительная простота в культивировании, технологичность, безвредность позволяют использовать их в условиях сельскохозяйственного и промышленного производства.
- Київ+380960830922