Разработка методов определения видовой принадлежности мяса на основе ДНК-диагностики и иммунодиффузии в геле

2
СОДЕРЖАНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ 4
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 6
1.1. Идентификация мяса и мясной продукции 6
1.1.1. Метод электорофоретичсского разделения белков: принципы
и использование в экспертизе пищевых продуктов. 11
1.1.2. Энзимологические методы 15
1.2 Иммунологические и молекулярногенетические методы
идентификации продукции. 18
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 44
2.1. Цель и задачи исследования 44
2.2. Объекты и методы исследования 44
2.2.1 Методика выделения ДНК из мяса крупного рогатого скота. 44
2.2.2. Мсчение биотином бактериальных ДНК методом ник-
трансляции : 45
2.2.3. Мечение ДНК методом «рассеянной затравки» 45
2.2.4. Методика получения меченых ДНК зондов с помощью
полимеразной цепной реакции 47
2.2.5. Методика точечной ДНК-гибридизации на мембранных
фильтрах с биотинилированной ДНК 48
2.2.6. Методика гибридизации нуклеиновых кислот с тритиевой
меткой 49
2.2.7. Методика полимеразной цепной реакции 50
2.2.8. Методика определения видовой принадлежности мяса
методом иммунодиффузии в геле 51
2.2.9. Статистическая обработка результатов 52
з
2.3 Результаты исследований 53
2.3.1. Разработка модификаций методов определения
видовой принадлежности мяса и мясопродуктов на основе 53
ПЦР 53
2.3.1.1. Разработка метода идентификации говядины на основе ПЦР и
электрофоретического разделения амплификатов 53
2.3.1.2. Разработка модификации метода количественного определения ДНК говядины на основе ПЦР с меченными 59 ну клеозидтри фосфатами
2.3.2. Разработка модификаци методов определения видовой принадлежности мяса крупного рогатого скота на основе
ДІ ІК-зон дов 61
2.3.3. Разработка тест-системы видовой принадлежности мяса и
субпродуктов первой категории на основе реакции иммунодиффузии в геле 68
2.3.4. Приборная реализация методов идентификации мяса 70
2.3.4.1. Автоматизация методов идентификации мяса 70
2.3.5. Разработка тест-систем идентификации мяса для
стационарных и полевых условий 76
2.3.5.1. ІІриборная реализация методов идентификации для
нестационарных условий 76
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 82
4. ПРЕДЛОЖИІИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ 92
ВЫВОДЫ 93
СІ ІИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 10
11
Наиболее перспективными в плане определения видовой принадлежности являются методы ДНК-диагностики, позволяющие проводить анализ как сырья, так и продукции, подвергнутой термической обработке (Fairbrother K.S.,Hopwood AJ.,Locklev A.K.,Bardsley R.G. 1998).
1.1.1. Метод электорофоретического разделения белков: принципы и использование в экспертизе пищевых продуктов.
Среди наиболее часто используемых электрофоретических методов можно отметить изоэлектрофокусирование и метод диск-электрофореза в нативных и денатурирующих условиях (Hoffmann К., 1997). Существуют также и другие варианты электрофореза. Так, в 1965 году Гроссбах описал модификацию диск-электрофореза на полиакриламидном геле для определения 10'9 г количества белка с помощью стеклянных капилляров. По использованию электрофоретических методов в научных исследованиях был опубликован ряд обзоров и практических пособий.
Однако в таких «научных» вариантах использовать электрофоретические методы в экспертных лабораториях, представлялось затруднительным, поскольку существующие до недавнего времени электрофоретические приборы не позволяли проводить быстрый и воспроизводимый микроанализ. Это определялось тем, чзо экспериментатору требовалась длительная предфорезная подготовка и, прежде всего, приготовление полиакриламидных гелей, которые готовились по различным рецептам (включали различные добавки) и не были стандартными. Непосредственно электрофоретическое разделение белков, а также окраска гелей также занимали несколько часов рабочего времени и требовали пристального внимания экспериментатора.
Все эти проблемы были решены благодаря созданию
автоматизированных приборов, обеспечивающих быстрое разделение белков и окраску гелей в стандартных условиях, что и позволило использовать метод электрофореза в практике сертификационных лабораторий. К таким приборам относится система Phast Sistem (Pharmacia, Швеция). Фирмой
12
выпускаются готовые полиакриламидные гели для различных видов фореза и электрофокусирования с различным размером пор, а также содержащие амфолины с определённым градиентом pH (Jannscn Е.,1986).
Электрофоретическое разделение белков основано на различии в скорости их движения в электрическом ноле. Электрофоретическая подвижность заряженных молекул белка зависит от их суммарного заряда, размера и формы молекул (Seymour С., 1993).
Величина заряда зависит от соотношения основных и кислых ионизированных групп в молекуле, которое определяется аминокислотным составом белка, pH и ионной силой среды. С увеличением суммарного заряда подвижность макромолекул возрастает, при этом скорость перемещения белковых частиц обратно пропорциональна их размеру. С увеличением размера молекул уменьшается их подвижность в результате увеличения сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой по сравнению с молекулами меньших размеров. Этими же причинами обусловлено различие в подвижности глобулярных и фибриллярных белков.
Широкое распространение получило разделение белков с помощью зонального электрофореза с применением твёрдых носителей (бумага, агар, крахмал, акриламид), насыщенных соответствующими буферами. Будучи гидратированными и пористыми, указанные материалы обладают в то же время механической жёсткостью. Твёрдая среда исключает возможность смещения границ белковых фракций в результате конвекции или вибрации.
В настоящее время для разделения макромолекул в основном применяются полиакриламидные гели (ПААГ), которые получают при сополимеризации акриламида и N, N’-метилендиакриламида в присутствии персульфатного катализатора. Использование гелей в качестве носителей при электрофорезе обеспечивает возможность широкого варьирования размеров пор, градиента pH, использования этих гелей с различными буферными