2
СОДЕРЖАНИЕ Введение..................................................................4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Основные положения об идентификации и фальсификации пищевого сырья и
готовой продукции..................................................8
1.2 Виды фальсификаций мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных
изделий...........................................................10
1.3 Органолептические и морфологические показатели видовой принадлежности
мяса и мясных продуктов...........................................12
1.4 Физико-химические показатели видовой принадлежности мяса и мясных
продуктов.........................................................15
1.5 Инструментальные методы идентификации и выявления фальсификаций
видового состава мясного сырья и готовых мясных продуктов.........17
1.6 Сущность полимеразной цепной реакции (ПЦР)........................32
1.7 Применение метода ПЦР для видовой идентификации мясного сырья и
продуктов животного происхождения.................................35
1.8 Количественная оценка содержания компонентов животного происхождения
в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий с использованием метода ПЦР.........................................39
1.9 Заключение........................................................43
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Объекты исследования.........................................46
2.1.2 Методы выделения ДНК из проб исследуемого материала..........47
2.1.3 Метод полимеразной ценной реакции (амплификация ДНК).........53
2.1.4 Метод электрофоретического анализа продуктов ПЦР.............55
2.1.5 Учет и интерпретация результатов ПЦР.........................58
2.1.6 Конструирование и калибровка внутренних стандартов для конкурентной ПЦР..................................................59
2.1.7 Могол кольцспрсципитации в капиллярах........................60
2.1.8 Метод иммунодиффузии с бумажными дисками.....................63
2.2. Результаты исследований
2.2.1 Разработка и испытание одиолокусных и мультилокусной ПІДР-тест-систем для видовой идентификации тканей крупного рогатого скота, свиней и кур в составе мясного сырья и готовых мясных продуктов....65
2.2.1.1 Подбор ДНК-мишени, конструирование видоспецифичных праймеров и выбор метода экстракции ДНК..........................66
2.2.1.2 Оптимизация процесса амплификации в одиолокусных и мультилокусной ПЦР...............................................72
2.2.1.3 Изучение специфичности и чувствительности одиолокусных и мультилокусной ПЦР...............................................83
2.2.1.4 Конструирование контролен работы одиолокусных и мультилокусной ПЦР-тест-систем...................................87
2.2.2 Разработка методики конкурентной ПЦР для количественной оценки содержания компонентов животного происхождения в составе мясного сырья, полуфабрикатов и готовых мясных изделий.......................105
2.2.2.1 Конструирование внутренних стандартов для постановки конкурентной ГІЦР...............................................107
2.2.2.2 Калибровка внутренних стандартов и определение точек эквивалентности для количественного определения ДНК крупного рогатого скота, свиней и кур методом конкурентной ПЦР.............................................................109
2.2.3 Изучение влияния технологической обработки мясного сырья на эффективность различных методов видовой идентификации................117
2.2.3.1 Влияние условий хранения мясного сырья на эффективность иммунологических и ПЦР методов видовой идентификации...................................................119
2.2.3.2 Влияние термической обработки мясного сырья на эффективность иммунологических и ПЦР методов видовой идентификации...................................................125
2.2.4 Обсуждение результатов исследования............................132
3. Выводы..................................................................162
4. Практические предложения................................................163
5. Список литерату ры......................................................164
6. Приложение (акт)........................................................180
1.5 Инструментальные методы идентификации и выявления фальсификаций видового состава мясного сырья и готовых мясных продуктов
В настоящее время для установления видовой принадлежности мясного сырья и готовых мясных продуктов, а также выявления фальсифицирующих примесей в их составе разработан и применяется целый арсенал специальных инструментальных методов. По основным принципам действия эти методы подразделяют на спектроскопические, разделительные, биологические и электрохимические (87).
Спектроскопические методы. Спектроскопические методы основываются на способности молекул и атомов взаимодействовать с электромагнитным излучением, благодаря чему можно получить информацию о структуре, физико-химических и/или качественно-количественных показателях исследуемой пробы. Эта информация заключена в параметрах частоты или длины волны, определение которых проводят в испускающем или поглощающем энергию спектре (87).
В последние годы были разработаны различные модификации спектрометрических методов для идентификации видовой принадлежности мяса и мясопродуктов. Taylor с соавт. предложили определять видовую принадлежность как сырого, так и термообработанного мяса крупного рогатого скота, кур и кроликов масспектрометрическии методом путем выявления различий в актинах, гемоглобинах и альбуминах. Результаты анализов, по заключению авторов, были весьма удовлетворительными. Однако при минимальных временных затратах (15 мин.) проведение такого анализа требует наличия сложного и дорогостоящего оборудования (172).
Японские исследователи идентифицировали видоспецифичные пептиды тяжелых цепей атриал-спсцифичного миозина кур методом электронного парамагнитного резонанса. Однако этот способ также не нашел широкого распространения (54). Helle N. и др. изучали возможность применения методов термолюминисценции и электронного парамагнитного резонанса. По
результатам работы был сделан вывод о наличии специфических спектров для различных видов рыб и ракообразных (19).
Практически одновременно несколькими зарубежными лабораториями был разработан метод инфракрасной спектроскопии, позволяющий проводить видовую идентификацию мяса (149) и оценивать качество мясной продукции (76).
Однако, несмотря на ряд преимуществ, перспективность дальнейшего развития группы спектроскопических методов остается пока проблематичной.
Разделительные методы. Разделительные методы часто сопутствуют спектроскопическим и биохимическим методам анализа и позволяют получать информацию о составе того или иного продукта посредством разделения его компонентов на отдельные составляющие (26). Такие разделительные технологии, как газовая хроматография и электрофорез, были разработаны еще в 70-х годах прошлого столетия. Принципы их действия легли в основу современных разделительных методик, характеризующихся повышенной чувствительностью, высокой скоростью детекции, а также возможностью их автоматизации и использования в “on-line” режиме (87), что позволило широко использовать модификации разделительных методов для анализа пищевых продуктов.
Немецкие ученые Helle N. и др. методом газовой хроматографии в экстрактах мышечной ткани различных видов животных определяли углеводороды, циклобутаноны и полиненасыщенные жирные кислоты, обеспечивающие межвидовые различия. Изучались холестерин и его эфиры, жирно-кислотный состав и основные физико-химические характеристики липидов и липопротеидов. Последние методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности фракционировались на липопротеиды высокой и низкой плотности. Этими же авторами методами высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии проводилось дифференцированное определение орто - и мета - тирозина, которые, по мнению ученых, могут рассматриваться как специфичные видовые аминокислотные маркеры. По многим из указанных показателей были обнаружены определенные видовые различия, на которых,
- Київ+380960830922