Ви є тут

Индикация Staphylococcus aureus методами ДНК-диагностики в молоке и молочных продуктах

Автор: 
Горяинова Галина Михайловна
Тип роботи: 
диссертация кандидата биологических наук
Рік: 
2004
Кількість сторінок: 
126
Артикул:
171212
179 грн
Додати в кошик

Вміст

2
СОДЕРЖАНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ................................................. 4
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР........................................ 8
1.1 Характеристика стафилококков..............................'. 7
* 1.2 Staphylococcus aureus и другие возбудители мастита коров .... 12
1.3 Санитарное значение золотистого стафилококка в молоке и
молочных продуктах....................................... 17
1.4 Методы индикации Staphylococcus aureus.................... 21
1.4.1 Микробиологические методы................................. 21
# 1.4.2 Методы ДНК - диагностики.................................. 26
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................. 35
2.1 Материалы и методы........................................ 35
2.1.1 Методы идентификации Staphylococcus aureus................ 35
2.1.2 Методы определения Staphylococcus aureus в молоке и
• * молочных продуктах......................... 36
2.1.3 Метод дифференциального получения и индикации
вегетативных и L - форм Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах....................................... 39
^ 2.1.4 Методика выделения ДНК из Staphylococcus aureus........... 40
2.1.5 Включение метки в ДНК методом ник-трансляции.............. 41
2.1.6 Получение и мечение ДНК-зондов в реакции амплификации .. 44
2.1.7 Методика ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с
ДНК, меченной тритием.................................... 45
• 2.1.8 Методика ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с
ДНК, меченной биотином................................... 46
2.1.9 Методика гибридизации колоний............................. 47
2.1.10 Методика полимеразной цепной реакции...................... 48
2.1.11 Амплификация ДНК методом “рассеянной” затравки............ 49
2.1.12 Статистическая обработка результатов...................... 50
51
51
55
66
70
76
88
90
91
110
Результаты исследований...............................
Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе
полимеразной цепной реакции...........................
Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием
генных зондов.........................................
Идентификация бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминаций молока от
коров, больных маститом.......................
Оценка методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных
продуктов ............................................
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................
ВЫВОДЫ................................................
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ..............................
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................
ПРИЛОЖЕНИЕ..........................................
декарбоксилируют. Вырабатывают протеазы, липазы, фосфолипазы, липопротеинлипазы, эстеразы и лназы. Большинство штаммов расщепляют природный животный белок (гемоглобин, фибрин, белок яиц, казеин, желатин), фосфолипопротеин гидролизует липиды с освобождением жирных кислот (6, 7, 8, 13).
Стафилококки относятся к аэробам и факультативным анаэробам, могут расти в различных атмосферных условиях, в том числе и в атмосфере, содержащей 20-30% углекислоты, образуя при этом сильный токсин. Они хорошо растут на обычных питательных средах, имеющих слабощелочную реакцию. Оптимальная температура для выращивания стафилококков 35-40°С, температурная граница роста в пределах 6,5-46°С, pH - 4,2-9,3 с оптимумом 7,0-7,5. Большинство штаммов размножается в присутствии 15% хлорида натрия или 40% желчи (6, 8, 34, 36).
Стафилококки хорошо растут на бульоне, образуя сначала равномерную муть, а затем рыхлый осадок, который через некоторое время превращается в тягучую массу (20, 55, 58).
Чаще всего для выращивания стафилококков используются агаровые среды с 5% кроличьей, бараньей или лошадиной крови. На таких средах их колонии окружены широкой зоной гемолиза (13, 36).
Прибавление к жидкой питательной среде 15%, а к агару - 7,5% хлористого натрия даст возможность получить элективную среду для выделения стафилококков (34, 36, 55, 63).
Среда из питательного агара с 6,5% хлористого натрия, к которому добавляют 10% снятого молока, обеспечивает достаточно быстрый рост стафилококков и хорошо выявляет пигмент (20, 55, 58, 63, 81).
Стафилококки резистентны к лнзоциму и чувствительны к лизостафину, макролидам, тетрациклину, новобиоцину, хлорамфениколу, фенолам и его производным, поверхностно-активным веществам, салициланнлидам, карбонилидам, галогенам и их производным, таким как хлорамин и йодоформ
1.2 Staphylococcus aureus и другие возбудители мастита коров
Стафилококковые инфекции широко распространены у животных и человека. Известно, что они служат причиной возникновения сепсиса, карбункулов, фурункулов, бактериемии, поражения верхних дыхательных путей, пневмонии, заболеваний желудочно-кишечного тракта, мастита и других заболеваний, а также широко распространенных пищевых отравлений.
Мастит - воспаление молочной железы является сложной реакцией организма, возникающей в ответ на действие болезнетворных факторов, характеризуется патологическими изменениями, как в тканях, так и в секрете молочной железы.
Особое значение в возникновении мастита имеет микробный фактор. Течение воспалительного процесса в вымени всегда сопровождается инфекцией. При этом микроорганизмы могут быть непосредственной причиной возникновения мастита или наслаиваться и осложнять развивающиеся процессы в вымени, возникающие в результате воздействия на молочную железу неблагоприятных факторов внешней среды.
Наиболее важными и частыми возбудителями являются стафилококки, стрептококки серогрупп В, С, Е, эшерихии, псевдомонады, коринсбактсрии, микоплазмы, кампилобактсрии и др.
Однако принято считать, что основными возбудителями мастита являются патогенные стафилококки и стрептококки, которые наиболее часто выделяются из молока и секрета вымени больных коров и могут вызвать заболевание в 90% случаев, при этом стафилококки выявляются в 22,9-59,5% случаев, а стрептококки - 11,7-47,1% (30, 45, 63, 88, 95, 199).
Молоко, полученное от коров, больных субклиническим и клиническим маститом содержит стафилококки, в том числе золотистые. По данным ряда авторов, золотистый стафилококк является наиболее частым возбудителем среди всех стафилококков и на его долю приходится от 9,6 до