РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота ґрунтується на систематичному вивченні органів імунної системи клінічно здорового молодняка (n = 34) великої рогатої худоби (з 21 добового до 24 місячного віку) чорно-рябої породи, вирощеного в колективних господарствах та індивідуальному секторі Дубровицького і Рокитнівського районів Рівненської області. Територія цих господарств відноситься до третьої зони радіоактивного забруднення, згідно Постанови Кабінету Міністрів України за № 106 від 23 липня 1991 року.
Дослідження проводились протягом 1997-2000 років на кафедрі патологічної анатомії і гістології Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. С.З. Ґжицького, в радіологічному відділі Рівненської обласної державної лабораторії ветеринарної медицини, Дубровицькій районній лабораторії ветеринарної медицини Рівненської області.
Вивчення вікових особливостей імунного статусу молодняка великої рогатої худоби, вирощеного в умовах постійного впливу малих доз радіації, проводилось у трьох групах: І група - телята 21-30 добового віку (n = 5); ІІ група - 6-7 місячного віку (n = 9); ІІІ група - молодняк 18-24 місячного віку (n = 20).
Для контролю був використаний молодняк великої рогатої худоби (n = 11) аналогічного віку та породи з благополучних по інфекційних хворобах господарств Яворівського та Городоцького районів Львівської області, де рівень радіації був у межах природних фонових величин.
Матеріал для дослідження відбирався під час забою тварин на Сарненському м'ясокомбінаті та забійному пункті райзаготконтори м. Дубровиці Рівненської області. Контроль - на Львівському м'ясокомбінаті та забійному пункті райзаготконтори м. Яворова, Львівської області.
Перед забоєм тварин зважували, вимірювали їх прижиттєвий радіаційний фон (гамма-радіометр СРП 6801). Вміст радіонуклідів в м'язах і паренхіматозних органах визначали за допомогою гамма-радіометрів РУБ-01П6 та РУГ-91 "Адоні". Матеріал для дослідження, як дослідний так і контрольний, відбирали переважно в осінній період .
Кров для дослідження брали з яремної вени. Гемоглобін визначали методом Салі, загальну кількість еритроцитів і лейкоцитів підраховували у камері Горяєва. Лейкограму виводили на основі підрахунку 200 клітин у мазках крові пофарбованих за Папенгеймом [93; 108]. Кількість Т-лімфоцитів визначали шляхом прямого розеткоутворення з еритроцитами барана, В-лімфоцитів в реакції з еритроцитами барана, попередньо обробленими антитілами і комплементом [76; 100; 110; 185; 240].
Для гістологічного, гістохімічного та морфометричного досліджень відбирали тимус, селезінку, лімфатичні вузли (поверхневі шийні, латеральні заглоткові, каудальні середостінні, порожньої кишки). Матеріал фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну, 80° (при +4°С) охолодженому спирті, рідині Карнуа із подальшою заливкою у парафін через хлороформ [126] .
Гістозрізи виготовляли на санному і заморожуючому мікротомах. Для фарбування гістозрізів використовували загальноприйняті і спеціальні гістологічні, а також деякі гістохімічні методики: гематоксилін та еозин, Ван-Гізон - на колагенові волокна, Перлса - на виявлення гемосидерину, Ейнарсона - комплексне визначення нуклеїнових кислот, Браше - на РНК і ДНК, Гоморі - на лужну і кислу фосфатази; [87; 98; 144].
Виконання всіх гістохімічних методів супроводжувалося необхідним контролем для підтвердження їх специфічності.
Морфофункціональне вивчення тимуса, лімфатичних вузлів та селезінки, у зв'язку з великою мінливістю їхніх структур, має певну специфіку ?127?. Тому, дослідження цих органів часто виконують за допомогою кількісної морфології [3; 4]. За останні роки в морфології успішно використовується системний підхід до вивчення різних процесів. Як вказують [2; 5] системний аналіз на різних структурно-функціональних рівнях біологічної організації може дати найдостовірніші відомості про об'єкт дослідження. Враховуючи, що в спеціальній літературі відсутні методичні розробки по системній стереометрії органів імунної системи молодняка великої рогатої худоби, перед нами виникла необхідність розробити практично доступний спосіб використання цього методу для морфофункціональної оцінки імунокомпетентних органів на різних рівнях їхньої структурної організації. З метою одержання об'єктивних і порівняльних результатів, морфометричні дослідження тимуса, селезінки та лімфатичних вузлів проводили за відповідними алгоритмами. Алгоритм морфометрії кожного з цих органів передбачає поетапне виконання в певній послідовності морфо- і стереометричних досліджень на органному, тканинному і клітинному рівнях.
При дослідженні тимуса і селезінки, на органометричному рівні визначали масу і об'єм; лімфатичних вузлів - форму. На основі органометричних даних тимуса і загальної маси тварини вираховували індекс тимуса (Іт).
де m - маса тимуса; М - маса тварини; 1000 - коефіцієнт перерахунку [13].
Гістологічне дослідження розпочинали з морфофункціональної оцінки різних мікроструктур. Для стереометричного аналізу гістоструктур використовували стереологічну методику волюметрії із застосуванням окулярної морфометричної сітки.
В тимусі визначали середній діаметр часточок, співвідношення паренхіми і строми. У паренхімі органа - відносні та абсолютні показники кіркової і мозкової речовин, кількість та середній діаметр тілець Гассаля у часточці. Щільність заселення клітинами кіркової і мозкової речовин тимуса.
У лімфатичних вузлах визначали співвідношення кіркової і мозкової речовин, частку лімфатичних вузликів у загальному об'ємі органу і кіркової речовини. Вимірювали середній діаметр лімфатичних вузликів. Визначали чисельність популяції лімфоцитів, макрофагів, клітин плазматичного ряду в кірковій і мозковій речовинах, лімфатичних вузликах.
У селезінці виводили процент білої та червоної пульпи, трабекулярного апарату у відношенні до загальної маси органу. Вимірювали середній діаметр лімфатичних вузликів. Підраховували чисельність популяцій лімфоцитів, макрофагі