РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материал собирали в течение 1992-1994 гг., в преднерестовый- нерестовый (апрель-июль) и посленерестовый-предзимовальный (сентябрь-ноябрь) периоды годового цикла камбалы в районе поселка Кача, а также в экспедиционных рейсах ИнБЮМ НАНУ и ЮгНИРО в октябре 1992 г. и ноябре 1994 г. в районе Евпатории. Рыбу отлавливали камбальными сетями около поселка Кача и тралом в рейсах, с глубин 75-80 м. Отловленную сетями рыбу доставляли в бассейн с проточной водой и выдерживали в течение суток.
Биологический анализ материала проводили по общепринятой методике [90]. Длину рыб измеряли от рыла до начала лучей хвостового плавника. Определяли массу рыб и стадию зрелости.
Представление о характере собранного материала дает таблица 2.1.
Таблица 2.1
Характеристика материала
ПериодыС а м ц ыС а м к и
экз
Длина,
см
Масса,
кг
Стадии
зрелости
экз
Длина,
см
Масса,
кг
Стадии
зрелостиПреднерестовый, нерестовый (апрель-июль)
54
32-49.5
1.2-3.73
IV, IV-V, V
17
35-51.5
1.6-4.9
IV, IV-V, V, VI-VПредзимовальный (сентябрь-ноябрь)
15
28.5-47.5
0.7-4.2
VI-II, II, III
15
37-60
1.1-7.0
VI-II, II, III
Размеры самцов и самок калкана соответствуют возрастам, при которых соматический рост стабилизируется и основная часть популяции достигает дефинитивных размеров. Более подробная характеристика материала представлена в "Результатах исследования".
Содержание сухого вещества (СВ), общего белка, нуклеиновых кислот (РНК и ДНК), гликогена (Гл), тотальных липидов (ТЛ), фракционный состав липидов (ФСЛ), включая классы фосфолипидов (ФЛ), триацилглицеринов (ТАГ), холестерина (ХЛ), эфиров стеринов (ЭС) и неэстерифицированных жирных кислот (НЭЖК), и жирнокислотный состав (ЖКС) ФЛ и ТАГ исследовали в печени, красных и белых мышцах и гонадах. Для этих же тканей рассчитывали индекс РНК/ДНК, коэффициент Дьерди (ХЛ/ФЛ), отношение НЭЖК/ТАГ и ЭС/ХЛ. Пробы мышц отбирали в первых мышечных сегментах за жаберной крышкой со спинной стороны. Пробы печени исследовали в ее верхней лопасти. Для отбора проб гонад использовали срединные фрагменты. Представление о количестве обработанных проб дает таблица 2.2.
Таблица 2.2
Количество проб
ПоказательСВГлТЛФСЛЖКСБелокРНКДНККоличество проб38335638523061386380382
Cодержание сухого вещества определяли в навесках тканей, доведенных до постоянного веса при температуре 1050С. Для высушивания использовали прокаленные алюминиевые чашечки. По разнице между массами чашечек с сухой и сырой навесками определяли содержание сухого вещества в пробе.
Содержание сухого вещества % = масса сухой навески/масса сырой навески Х 100%.
Для определения содержания гликогена, рыбу предварительно выдерживали сутки в проточной воде, а после отлова оглушали механическим ударом. Немедленно после оглушения, взятые образцы тканей промораживали в жидком азоте и отбирали навески печени 30 мг, красных мышц 40 мг, белых мышц 200 мг и гонад 200 мг. После щелочного гидролиза на кипящей водяной бане и нескольких переосаждений получали гликоген в осадке. Дальнейшее определение содержания гликогена проводили с антроновым реактивом колориметрически [91, 212].
Определение содержания тотальных липидов, липидных фракций, белка и нуклеиновых кислот проводили из одной навески. Концентрацию тотальных липидов рассчитывали после предварительной экстракции из гомогенизированной навески смесью Фолча (хлороформ:метанол 2:1). Ткани гомогенизировали на холоду в стеклянных гомогенизаторах Поттера. Экстракт несколько раз (3-4 раза) очищали от нелипидных примесей водносолевым раствором [159], переносили в стеклянные пробирки с тщательно притертыми пробками. Дальнейшее колориметрическое определение концентрации суммарных липидов проводили с фосфорнованилиновым реактивом [140]. Фракционный состав липидов исследовали методом тонкослойной хроматографии на пластинках "Silufol" UW-254 ("Кавалиер" ЧССР) по методике, модифицированной Ю.П. Копытовым [46], с незначительными изменениями относительно подготовки пластин. Пластинки промывали этилацетатом, высушивали при комнатной температуре. Перед работой пластинки активировали 30 минут при температуре 1050С в сушильном шкафу, обрабатывали 10%-ным спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты и высушивали в токе теплого воздуха 10-15 минут. Хлороформенный раствор липидов пробы наносили на пластинку микродозатором ("Унипан"-328 ПНДР) в количестве, не превышающем 200 мкг липидов. Дальнейшая работа осуществлялась в точном соответствии с методикой. Разделение липидов проводили методом одномерной хроматографии с двукратной разгонкой в системе растворителей с обратным градиентом полярности - хлороформ; гексан: диэтиловый эфир (9:1); гексан. Градиент полярности достигался особым устройством хроматографической камеры, которая состояла из трех камер, погруженных одна в другую. Первая камера насыщалась хлороформом, вторая - смесью гексан: эфир, третья - гексаном. Все растворители предварительно очищали перегонкой [38]. Хроматограммы проявляли нагреванием в сушильном шкафу при температуре 1100С в течение 7 минут. Липидные фракции идентифицировали с помощью свидетелей, специфическими цветными реакциями и сопоставлением с известными в литературе значениями Rf [4, 38, 40, 115]. Количественное определение липидного состава проводили на денситометре ERI - 65 (Карл Цейс, ГДР) с последующей оценкой денситограмм методом взвешивания пиков [38].
Для определения жирнокислотного состава фосфолипидов и триацилглицеринов предварительно проводили тонкослойную хроматографию липидов на силикагеле марки LS 5/40 в системе растворителей гексан: диэтиловый эфир: уксусная кислота (75: 25: 2) [129]. Одновременно с пробой разделяли соответствующие стандарты. После разделения и идентификации фракций фосфолипидов и триацилглицеринов, их переносили с силикагелем в широкие стеклянные пробирки со шлифом и метилировали 1.5 - 2 часа в 0.21N растворе NаOH в абсолютн