РАЗДЕЛ 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Метод получения экспериментального диабета
Для получения модели экспериментального диабета мы использовали самцов крыс линии Вистар в возрасте 21 постнатального дня. Диабет вызывался одной внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина растворенного в 0.9 процентном растворе NaCl (изотонический 0.9% раствор для инъекций, Галичфарм, Львов, Украина), из расчета 80 мг на кг веса животного. Описание механизма действия стрептозотоцина приведено в обзоре литературы.
Стрептозотоцин - инъецированные и контрольные животные такого же возраста содержались на одинаковой диете на протяжении всего периода развития заболевания. Часть животных бралась в эксперимент через один день после инъекции стрептозотоцина, для проверки токсического действия стрептозотоцина, (стрептозотоциновый контроль). Исследования, проведенные на данной группе животных, не выявили отличий в кальциевой сигнализации, поэтому данная группа не была включена в общую статистику и в дальнейшем не рассматривалась. Остальных животных использовали в эксперименте через 3-5 недель после инъекции стрептозотоцина.
Концентрация глюкозы в плазме крови, взятой из хвостовой вены, измерялась при помощи оптического сенсора глюкозы Глюкотренд (Roche Diagnostics GmbH., Mannheim, Германия). Концентрация глюкозы в плазме крови находилась в пределах 5 - 9 мМ у контрольных животных и 14 - 28 мМ у животных со стрептозотоцин - индуцированным диабетом.
Эксперименты с животными были утверждены и проводились в соответствии с требованиями Клиники подопытных животных Института физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины.
2.2 Экспериментальный метод проверки наличия нейропатии
2.2.1. Метод "формалиновый тест"
Данный метод применяется для исследования поведенческих реакций животных при острой боли. Две группы животных, в нашем случае крысы со стрептозотоцин - индуцированным диабетом в возрасте 6-8 недель и соответствующие им по возрасту контрольные животные, помещают в одинаковые условия наблюдения. Ноцицептивный стимул вызывали подкожным введением 20 мкл 5% раствора формалина в заднюю лапу животного как контрольным, так и крысам со стрептозотоцин - индуцированным диабетом. В дальнейшем на протяжении полутора часов за каждой крысой велось наблюдение и ее поведенческие реакции (такие как перемещения, потребление пищи и воды, лизание поврежденной конечности, подергивания поврежденной конечности) - регистрировали с использованием компьютера. Регистрация и предварительный анализ полученных данных производился при помощи программы написанной в нашей лаборатории. Статистический анализ данных производился при помощи программы Microsoft Excel.
2.2.2. Метод "горячая поверхность"
Данный метод позволяет изучать болевые реакции крыс на термический стимул, а также определять порог болевой термической чувствительности. Ноцицептивный стимул создавали путем помещения экспериментального животного на поверхность разогретую до температуры способной вызвать болевую реакцию. Прибор для измерения данных параметров был сконструирован инженером Института физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины - Кабанченко С.И. Данный прибор представляет из себя массивную аллюминеевую плиту по поверхности которой обеспечивается равномерное нагревание; с помощью цифрового интерфейса управляемого компьютером, можно выставить значение температуры на плите с точностью до 0.1 ?С. После помещения на поверхность с заданной температурой экспериментального животного, начинался отсчет времени до наступления характерной болевой реакции - лизания задних конечностей. Статистический анализ данных производился при помощи программы Microsoft Excel.
2.3. Получение срезов спинного мозга
Тонкие срезы спинного мозга готовились по методике Рандич и соавторов [144]. В эксперимент брались крысы линии Wistar в возрасте 6-7 недель. Под глубокой эфирной анестезией, производилась операция вскрытия оболочки спинного мозга, и извлекался люмбосакральный участок спинного мозга (сегменты L4 -S1). Сразу же после извлечения, спинной мозг помещался в охлажденный до 4?С инкубационный раствор, постоянно оксигенируемый смесью 5% CO2 + 95% O2, в котором производились все операции, связанные с выделением. После очистки спинного мозга от твердой оболочки, его прикрепляли к предметному столику вибротома (Campden Instruments LTD, Англия), с помощью которого нарезались тонкие срезы спинного мозга (300 мкМ). После нарезки срезы отстаивались на протяжении, по крайней мере, 1 часа в постоянно оксигенируемом базовом растворе при температуре 32?С. Затем срезы подвергали окраске флуоресцентным кальций - чувствительным красителем фура-2/АМ и помещали в экспериментальную камеру для последующих экспериментов, методика окраски и схема экспериментальной установки описаны ниже.
2.4. Флуоресцентная кальцийметрия
2.4.1. Характеристики кальциевого зонда
Для количественного определения концентрации кальция в нейронах дорсального рога спинного мозга использовалась мембрано- проникающая форма красителя фура-2 (фура- 2/АМ), химическая формула данного соединения представлена на рисунке 2.1.
При связывании фура-2 с кальцием происходит характерное смещение спектра возбуждения этого красителя. При возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение интенсивности флуоресценции, а при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм - увеличение. На рисунке 2.2. представлены спектры излучения зонда фура-2, при различных концентрациях свободного кальция в растворе. Максимум флуоресцентной эмиссии приходится на длину волны 510 нм, спектры возбуждения и поглощения красителя фура-2 представлены на рисунке 2.3.
Однако, длина волны 340 нм является уже ультрафиолетовым светом, и для ее использования необходим микроскоп с кварцевой оптикой. Поскольку в нашем случае был использован обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана длиной 390 нм. 360 нм - это изобестическая точка зонда фура -2, т.е. флуоресцентный сигнал при возбуждении светом данной длины волны не зависит от конц
- Київ+380960830922