РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень
Дослiдження проведенi на клiтинах слинних залоз личинки Chironomus plumosus L. (клас Insecta, ряд Diptera, родина Chironomidae, рід Chironomus Meig.). Згідно класифікації Заварзіна А.А. [11] ці залози вiдносять до групи малоклiтинних, тобто вони є популяцією клітин, що знаходяться у структурному і хімічному взаємозв'язку та спеціалізовані у різних напрямках.
Залози розташованi у другому та третьому грудних сегментах личинки по обидва боки стравоходу. Внутрішню секреторну порожнину залоз обмежує одношаровий епiтелiй. Залози мають вигляд овального сплющеного мiшечка з невеликими лопатями (рис. 2.1) i подiляються на нижню, бокову, передню,
Рис. 2.1. Мікрофотографія нативної слинної залози личинки Chironomus plumosus L.: а - нижня частка;
б - основна частка;
в - верхня частка,
г - передня частка;д - бокова частка;
е - порожнина залози;
ж - вивідна протока.верхню і основну частки [13]. Між передньою та верхньою частками знаходиться вивідна протока, а до нижньої та верхньої прикріплені зв'язки, за допомогою яких залоза вільно фіксується в порожнині тіла.
Максимальної величини (2 мм у довжину та 0,8 мм в ширину) слинна залоза досягає перед процесом метаморфозу за рахунок збiльшення розмiру клiтин в результаті послiдовних (до 15) ендомiтозiв, внаслiдок чого утворюється 38-48 великих клiтин з ядрами, що мiстять високополiтеннi хромосоми (рис. 2.2).
Ширина клітин у базальній частині лежить в межах від 200 до 340 мкм, а товщина - близько 30 мкм [11]. Клiтини слинної залози вкритi ззовнi товстою, пружною базальною мембраною, під якою знаходиться ПМ. Вздовж останньої розмiщенi мiтохондрiї, за якими знаходиться цитоплазма. Клiтини багатi ЕПР, який густо вкритий рибосомами.
Рис. 2.2. Мікрофотографія секреторної клітини нативної слинної залози личинки Chironomus plumosus L.:
1 - ядро;
2 - ядерце;
3 -хромосоми.Ядро i апарат Гольджі, з якими зв'язанi компактнi секреторні гранули розташованi ближче до внутрiшньої порожнини залози.
Слинні залози продукують в'язкий секрет, який за своїми властивостями подібний до фiброїну і, в основному, використовується для побудови хаток i ловчих сiток. Секрет також бере участь у травленні, оскільки містить ряд травних ферментів. Серед них у секреті слинних залоз личинки хірономуса міститься трегалаза, гіалуронідаза, пептидаза, РНКаза, ДНКаза, естераза, активність яких відповідно становить 9,1, 7,5, 6,2, 1,2, 9,7 од/мг білка [178]. Крім цього, секрет містить до 3% мукопротеїнів [35]. Білки секрету можуть утворюватися в СК залози або ж синтезуватися в клітинах інших тканин і транспортуватися до залози гемолімфою [13, 35].
Препарування залоз здiйснювали пiд мiкроскопом МБС-1 шляхом декапiтацiї личинки, видалення вмiсту перших чотирьох сегментiв, перерiзування слинної протоки i зв'язок за допомогою мiнiатюрних рiжучих iнструментiв у фiзiологiчному або відповідному розчинi.
Для досягнення поставленої мети було використано біофізичні та біохімічні методи. Струми Na+-Ca2+-обміну досліджували з використанням методу фіксації потенціалу за умов внутрішньоклітинної перфузії. Про секреторну активність залоз судили на основі змін кількості білка у супернатанті, а про зміни [Ca2+]в - на основі змін вмісту Ca2+ в тканині слинних залоз.
2.2. Розчини
Під час досліджень I(Na/Ca)вх за відсутності блокування ІТС ми використовували вихiдний розчин для внутрiшньоклiтинного дiалiзу, який містив, ммоль/л: NaCl - 16,0, трис-Cl - 146,14, глюкоза - 5,55; рН 7,0. Вихiдний позаклiтинний розчин мiстив, ммоль/л: NaCl - 136,9, KCl - 5,4, CaCl2 - 1,76, MgCl2 - 0,49, трис-Cl - 0,20, глюкоза - 5,55; pH 7,2. При використаннi цих розчинiв натрiєвий рiвноважний потенцiал становив +54 мВ. Дані розчини використовувалися у дослідженнях залежності функціонування Na+-Ca2+-обмінника у прямому режимі від активності Са2+-помпи та Na+-K+-помпи за умов внутрішньоклітинної перфузії, а також під час досліджень ролі SH-груп у функціонуванні Na+-Ca2+-обмінника, впливу донорів NO та залежності амплітуди I(Na/Ca)вх від рН позаклітинного та внутрішньоклітинного середовищ, які були проведені за відсутності попереднього блокування деяких ІТС.
При реєстрації I(Na/Ca)вх та I(Na/Ca)вих на одній і тій же клітині використовували вихідний позаклітинний розчин, в якому катіони К+ замінювали на еквімолярну кількість трис-Cl та додавали блокатор кальцієвих ПКК - верапаміл (10-4 моль/л). Базовий внутрішньоклітинний розчин у цьому випадку містив, ммоль/л: NaCl - 16,0, трис-Cl - 50,3, трис-SO4 - 79,84, глюкоза - 5,55, еозин Y - 10 мкмоль/л; рН 7,0. При використанні цих розчинів ЕNa становив +54 мВ, а ЕСl - +20 мВ. Такий склад розчинів дозволяє відокремити струми Na+-Ca2+-обміну від струмів кальцієвих, калієвих та хлорних ПКК, а також запобігти активації Са2+-помпи і Na+-K+-помпи ПМ.
З метою вивчення залежності функціонування Na+-Ca2+-обміну у прямому режимі від активності Na+-K+-помпи за умов внутрішньоклітинної перфузії досліджували вплив позаклітинних та внутрішньоклітинних катіонів К+, а також зміни натрієвого концентраційного градієнта на амплітуду I(Na/Ca)вх.
Для цього у першому випадку катіони К+ не додавали до вихідного позаклітинного розчину або ж збільшували [К+]з або [К+]в відповідно до 20 або 129,17 ммоль/л. У другому випадку [Na+]з зменшували до 16 ммоль/л, а [Na+]в збільшували до 100 ммоль/л. З метою блокування Na+-K+-помпи до необхідних позаклітинних розчинів додавали її специфічний блокатор - уабаїн у концентрації 25 мкмоль/л.
Для виявлення залежності амплітуди I(Na/Ca)вх від функціонування Са2+-помпи за умов внутрішньоклітинної перфузії до вихідного внутрішньоклітинного розчину додавали її блокатори, а саме, еозин Y у концентрації 10 мкмоль/л або ортованадат натрію у концентраціях 10 і 100 мкмоль/л.
З метою ідентифікації струму вихідного напряму, зареєстрованого у відповідь на раптову деполяризаці