РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Характеристика експериментальних моделей
В експериментах по дослідженню експресії генів дефенсинів в умовах in vitro було використано лінії злоякісно трансформованих клітин, такі як: M-HeLa (карцинома шийки матки людини), KB (епідермоїдна карцинома слизової оболонки ротової порожнини людини), COLO 320HSR (аденокарцинома товстої кишки людини), U251 (гліобластома людини), Molt-4 (гострий лімфобластний лейкоз людини), CEM (Т-клітинна лімфома людини), A 431 (епідермоїдна карцинома вульви людини) та клітинна сублінія А431/1522, яку було отримано в результаті трансфекції вихідної лінії клітин А431 ретровірусним вектором, що містить кДНК гена трансформуючого фактору росту типу альфа (TGF-?) людини [164, 165]. Експресія кДНК гена TGF-? перебуває під контролем промотора гена металотіонеїну МТ-1 миші [166].
Всі клітинні лінії отримано з колекції Інституту молекулярної біології ім. В.А. Енгельгардта РАН (Москва).
2.2. Штами мікроорганізмів та вірусів
Для визначення антимікробної активності в препаратах культурального середовища сублінії клітин А431/1522 використовували культуру бактерій Bacillus subtilis АТСС 6633. Індукція експресії генів дефенсинів в культурах трансформованих клітин проводилась з використанням культури мікроорганізмів штаму Bacillus subtilis ATCC 31029. Усі бактеріальні культури отримані з Української колекції мікроорганізмів з ІМВ НАНУ (Київ, Україна).
Реципієнтний штам Escherichia coli HB101, трансформований рекомбінантною плазмідою 1522, був люб'язно наданий Dr. Salomon D. (Лабораторія біології та імунології раку, Національний Інститут раку, Бетезда, США).
Лабораторний штам аденовірусів Adh5 (1301), отриманий з колекції інституту мікробіології Будапештського медичного університету, був люб'язно наданий к.б.н. Повницею О.Ю. з ІМВ НАНУ (Київ, Україна).
2.3. Клінічний матеріал
Пухлинний матеріал людини (первинні пухлини вульви та шийки матки), а також зразки нетрансформованого епітелію вульви та шийки матки було отримано з відділення онкогінекології Інституту онкології АМНУ (зав. відділення проф. Воробйова Л.І.) За клінічними даними зразки було верифіковано як плоскоклітинний рак вульви та шийки матки 1, 2 та 3 стадії (Табл. 2.1)
Таблиця 2.1
Клінічний матеріал пухлин вульвиКлінічний матеріал пухлин шийки матки№ВікTNM№ВікTNM162T2N2M0152T1N1M0258T3N1M1283T2N0M0352T2N0M0361T2N0M0450T2N0M0457T1N0M0562T3N1M0535T3N1M0667T3N1M0637T1NхM0762T2NхM0748T1N0M0 Таблиця 2.1 Продовження
852T3N1M1849T1N0M0976T3N2M0965T3N1M01060T3N0M01037T1NхM01164T2N0M01143T1N0M01269T2NхM01269T1N0M01361T3N0M01456T2N0M01571T3N2M01674T2NхMх1765T3N2M0
2.4. Умови культивування клітинних ліній
Клітинні лінії вирощували при 370С у середовищах DMEM або RPMI-1640 (з, або без фенолового червоного), що містили 5-10% сироватки великої рогатої худоби (Gibco BRL, Великобританія), в атмосфері 5% СО2. Для культивування використовувались пластикові флакони, та планшети (Nunc, Данія; Costar, США; Greiner, Німеччина), а також скляні чашки Петрі (Anumbra, Німеччина).
Експресію кДНК ТФР-? в клітинній сублінії А431/1522 індукували по досягненні конфлюентного стану шляхом зміни середовища на безбарвне, що містило 1,5 - 3 мкМ CdCl2 або ZnCl2, після чого клітини інкубували протягом 48 годин без сироватки. Середовища інкубації клітин збирали для використання в подальших експериментах.
В експериментах, що мало за мету оцінити рівень експресії генів дефенсинів за умов екзогенного впливу клітинам, що досягли конфлюентного стану, змінювали середовище на безсироваткове, в яке вносили наступні індуктори: живу та стерилізовану кип'ятінням культуру B.subtilis з розрахунку 2,5*109 клітин на 3 см чашку Петрі; ЕФР до кінцевої концентрації 1 мкг/мл. Після інкубації з цими ефекторами, клітини промивали буфером PBS.
2.5. Визначення індексу пригнічення синтезу ДНК в культивованих клітинах
Для оцінки проліферативної активності культури клітин А431 та трансфекованої кДНК ТФР-? сублінії клітин А431/1522 було застосовано варіант методу, основаного на інкорпорації радіоактивно міченого тимідину в ДНК [167]. Клітини інкубували в середовищі RPMI 1640 в присутності 0,5 мкКі/мл [3Н]-тимідину (Amersham) протягом 16-18 годин. Кожну пробу брали не менш, як в п'яти повторностях. Співвідношення кількості живих і мертвих клітин в культурах визначали за забарвленням 0,2% розчином трипанового синього. Клітини фіксували на скляних мікроволоконних фільтрах Whatman GF/C (США) 10% трихлороцтовою кислотою, після чого фільтри відмивали від радіоактивної мітки, що не включилась, 96% етанолом, сумішшю етанол : ефір (1:1) та ефіром. Включення мітки визначали на рідинному сцинтилляційному лічильнику Intertechnique SL-30 (Франція).
2.6. Визначення антимікробної активності
Антимікробну активність препаратів концентрованого кондиційованого середовища клітин А431/1522 визначали за пригніченням росту бактерій в тонкому шарі агарози за модифікованим методом [168]. Бактерії в логарифмічній фазі росту культури вносили в охолоджене до 40оС середовище LB, що містило 0,02% Tween-20 і 0,7% легкоплавкої агарози, у співвідношенні 1х106 бактерій на 1 мл середовища, та розливали в 70 мм пластикові чашки Петрі (Росія). Проби об'ємом 4 мкл вносили в лунки діаметром 3 мм, пробиті в шарі агарози. Після двох годин інкубації на чашки нашаровували 5 мл 2х LB-агарози і інкубували до появи видимого мікробного росту (1,5-4 години). Бактерії в агарозі фарбували 0,01% Coomassie Brilliant Blue G250 в суміші вода/етанол/оцтова кислота (9:2:1). Чашки фотографували і вимірювали діаметр зон пригнічення росту.
2.7. Отримання клітинних лізатів та визначення концентрації білків
Для визначення фосфокіназної активності рецептора ЕФР клітини промивали буфером PBS (1,5 mM KH2PO4; 8,1 mM NaH2PO4; 2,7 mM KCl; 140 mM NaCl) та лі