РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для вирішення задач, що поставлені в роботі, нами був проведений клініко-статистичний аналіз 817 історій хвороб жінок зі ЗН, які перебували в стаціонарі протягом 1995-1999 років. На другому етапі дослідження було комплексно обстежено 210 вагітних жінок. 180 вагітних із загрозою переривання вагітності до 12 тижнів та ЗН в анамнезі склали основну групу. 30 соматично та гінекологічно здорових жінок з фізіологічною вагітністю увійшли до контрольної групи. Для обстеження жінок були використані наступні методи дослідження.
2.1. Загальноклінічні
Всі вагітні підлягали загальному огляду, морфометрії, вивченню соматичного та акушерсько-гінекологічного анамнезу, гінекологічному огляду. Проводилися клініко-лабораторні обстеження: загальний аналіз крові та сечі, біохімічні дослідження крові. Вивчався перебіг даної вагітності та пологів.
2.2. Мікробіологічні
Враховуючи провідну роль інфекційних захворювань в етіології ЗН, всім жінкам проводилося обстеження на наявність TORCH-інфекцій. Було виконано:
- визначення наявності патогенної та умовно-патогенної флори в матеріалі із цервікального каналу, піхви та уретри бактеріоскопічним методом - забарвлення за Романовським-Гімза, за Грамом [50] та бактеріологічним методом з використанням поживних середовищ - м'ясо-пептонний агар, кров?яний агар, Сабуро [7];
- визначення Chlamydia trachomatis в матеріалі із цервікального каналу та уретри методом прямої імунофлюоресценції (ПІФ) з використанням набору реактивів "Хлами-Слайд" фірми Галарт-діагностикум (Москва) за методикою фірми-виробника;
- визначення Ureaplasma urealyticum та Mycoplasma hominis в матеріалі із цервікального каналу та уретри культуральним методом [53];
- визначення рівня специфічних антитіл (IgG) до Chlamydia trachomatis, Toxoplasma gondiї, Cytomegalovirus, Herpes simplex virus I/II типу в периферичній крові методом твердофазного імуноферментного аналізу з використанням наборів реактивів фірм "Orgenics" (Ізраїль), "Sanofi diagnostics Pasteur" (Франція), "Labsystems" (Фінляндія), "Equipar" (Італія), ЗАО "Вектор-Бест" (Росія) за методикою виробника. За позитивний результат вважали діагностичний рівень антитіл, виражений в титрах. Реакції проводили з використанням імуноферментних аналізаторів "Dombi-plate" (Росія), "Labsystems" (Фінляндія).
2.3. Гормональні
Всім вагітним проводилася гормональна кольпоцитологія, використовувався монохромний метод забарвлення гематоксилін-еозіном [52].
2.4. Ультразвукові
Ультразвукове дослідження проводилося в динаміці вагітності на апараті "Aloka" SSD-630 та "Siemens" SL-1. Для кращої візуалізації внутрішнього вічка шийки матки та товщини міометрію в ділянці нижнього маткового сегменту сканування проводилося при наповненому сечовому міхурі.
При скануванні вивчалися такі ознаки загрози переривання вагітності, як наявність на стінці матки ділянки гіпертонусу, що проявляється локальним потовщенням міометрію трьох ступенів вираженості, діаметр внутрішнього вічка шийки матки. Проводили ембріо- та фетометрію, встановлювали відповідність їхніх результатів терміну вагітності, визначеному іншими методами.
З метою діагностики хромосомних аномалій у ембріона в 9-14 тижнів вагітності проводили вимірювання комірцевого простору [84].
2.5. Імунологічні
Після проведення комплексного обстеження вагітних жінок зі ЗН в анамнезі на підставі відсутності анатомічних, інфекційних, ендокринних, генетичних причин невиношування була виділена група жінок з невиношуванням "нез'ясованої" етіології. З метою виявлення етіологічного фактору цим жінкам було проведено імунологічне обстеження.
Оцінка імунного статусу вагітних включала визначення субпопуляцій лімфоцитів в периферичній крові методом двокольорової проточної цитометрії [140] з використанням кон'югованих з флуоресцеїном або фікоеритрином моноклональних антитіл фірми Becton-Dickinson, США проти наступних поверхневих антигенів лімфоцитів: CD3, CD19, CD4, CD8, CD56, CD16, HLA-DR. Аналіз пофарбованих зразків проводили на проточному цитофлуориметрі FACScan з використанням програмного забезпечення FACScan Research Software (Becton-Dickinson). Підраховували показники відносного (%) та абсолютного (кількість клітин в 1 мкл крові) вмісту наступних субпопуляцій лімфоцитів: Т-лімфоцити (CD3+), В-лімфоцити (CD19+), природні кілери (CD3-CD16+CD56+), T-хелпери (CD3+CD4+), Т-кілери/супресори (CD3+CD8+), ефекторні, цитотоксичні Т-лімфоцити (CD3+CD56+), активовані Т-лімфоцити (CD3+HLA-DR+).
Жінкам зі ЗН "нез'ясованої" етіології в схемі комплексного лікування загрози переривання вагітності проводилася імунізація лімфоцитами чоловіка.
Методика імунізації лімфоцитами чоловіка
Алогенні лімфоцити для імунізації вагітних жінок виділяли з 100 мл крові чоловіка шляхом центрифугування крові на градієнті фікол-ізопак з щільністю 1,078 г/мл за методикою А.Boyum (1968). Виділення проводили у стерильних умовах, користуючись стерильним посудом, реактивами. Отримані мононуклеарні клітини ресуспендували у 2 мл ізотонічного розчину хлоріду натрію та вводили в день отримання вагітним внутрішньошкірно в 8-10 точок плеча в загальній кількості 100-150 млн клітин. Імунізацію проводили одноразово в 6-12 тижнів вагітності. Попередньо чоловіки були обстежені на наявність СНІДу, сифілісу, вірусних гепатитів, цитомегаловірусної інфекції, та лише при відсутності цих захворювань кров використовувалася для імунізації.
Жінкам цієї підгрупи та вагітним з контрольної групи до та через два тижні після імунізації, крім вищезгаданих методів, було проведено поглиблене імунологічне обстеження, яке включало вивчення проліферативної відповіді лімфоцитів жінки в змішаній культурі лімфоцитів та визначення рівнів цитокінів IFN-?, TNF, IL-4 в супернатантах ЗКЛ.
Реакцію змішаної культури лімфоцитів (ЗКЛ) виконували відповідно референс-протоколу, затвердженому секцією з репродуктивної імунології на 11 м