РОЗДіЛ 2
матеріали та методи дослідження
2.1. Загальна методика дослідження
2.1.1. Основні принципи загальної методики дослідження
Дослідження функціонального стану моноцитів та вивчення впливу лізосомальних
ферментів на моноцити при розвитку стрес – синдрому були проведені на кролях.
Це було обумовлено такими факторами:
1) Проведення дослідження функцій моноцитів потребує досить великої кількості
крові, тому що їх кількість у периферичній крові невелика [237, 238]. Цей
фактор перешкоджає досліджувати функції моноцитів на дрібних лабораторних
тваринах. Використання ж кролів як піддослідних тварин дає можливість відбирати
кров щодня, і відповідно це дозволяє простежити динаміку показника, що
досліджується при розвитку стрес-синдрому на одній особі, що підвищує
достовірність статистичного аналізу даних.
2) Дослідження впливу лізосомальних ферментів нейтрофілів передбачає визначення
морфологічних характеристик їх лізосомального апарату. Тільки у кролів лізосоми
нейтрофілів ідентифікуються методом світлової мікроскопії, що й забезпечує
безпосередній візуальний контроль за станом лізосомального апарату [188]. Крім
того, для лізосомального апарату нейтрофілів кролів визначені
морфофункціональні показники “норми”, що дозволяє порівнювати отримані дані із
загальновизнаними показниками [188].
Стресову ситуацію моделювали за допомогою іммобілізації кролів у положенні на
спині впродовж дванадцяти годин [11, 239 – 241].
Функціональний стан моноцитів визначали такими показниками:
* кількість РНК у моноцитах,
* показники інтегрального НСТ-тесту моноцитів,
* показники фагоцитозу моноцитів,
* активність пероксидази в моноцитах,
* активність неспецифічних естераз у моноцитах.
Вплив лізосомальних ферментів нейтрофілів на функціональний стан моноцитів
периферичної крові вивчали шляхом моделювання їх дефіциту у кровотоці при
стресі з подальшим порівнянням показників моноцитів за умов наявності та
дефіциту лізосомальних ферментів нейтрофілів, а також розрахуванням
коефіцієнтів кореляції між показниками функціонального стану моноцитів та
лізосомального апарату останніх.
Зменшення вмісту лізосомальних ферментів нейтрофілів у крові моделювали
селективною мієлодепресією цитостатичним специфічним препаратом мієлосаном (“АЙ
СИ ЭН ОКТЯБРЬ”, Росія), який зменшує кількість нейтрофілів у крові. Препарат
вводили перорально у дозах 5 мг/кг впродовж 5 – 7 діб до зменшення абсолютної
кількості нейтрофілів у 1 літрі крові на 40 – 50 % та по 2 мг/кг на добу з
метою підтримки стану пригнічення гранулоцитопоезу впродовж усього експерименту
[242].
Кінетику нейтрофілів визначали за допомогою підрахунку абсолютної їх кількості
у крові та показників, які характеризують гранулоцитопоез.
Функціональний стан лізосомального апарату нейтрофілів оцінювали за кількістю
лізосом та катіонних білків та наступним розрахунком абсолютної кількості
дегранульованих клітин, ступеня дегрануляції та декатіонізації, індексу
дегрануляції. Інтенсивність вивільнення лізосомальних ферментів нейтрофілів у
кровоток оцінювали за активністю в сироватці крові їх маркера – кислої
фосфатази.
Відповідно до вищевикладених принципів загальної методики дослідження, тварини
були розподілені на дві групи: перша – контрольна – кролі підлягали тільки дії
стресора; друга – дослідна – дія стресора відтворювалась на фоні зменшеної
кількості лізосомальних ферментів.
Тривалість постіммобілізаційного дослідження була встановлена експериментально:
дослідження припиняли після відновлення цитологічних характеристик моноцитів і
нейтрофілів. Термін експерименту склав 14 діб. Усі показники визначали до
іммобілізації, а також на 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 14 добу після такої. У
дослідній групі додатково вивчали вплив мієлосану на показники, які вивчалися.
Коефіцієнти кореляції розраховували згідно із загально прийнятою методикою
[243].
2.1.2. Умови дослідження
Дослідження проведені на 95-и кролях обох статей 5 – 7-и місячного віку,
беспорідних, вагою 2,5-3 кг.
Тварини утримувались за умов віварію при температурі 18-22° С та знаходились на
звичайному раціоні харчування.
Забор крові здійснювали вранці й натще. Максимальну кількість забору крові
визначили експериментально з контролюванням гематологічних показників.
Постановка експериментів відповідала нормативам “Международных рекомендаций по
проведению медико-биологических исследований с использованием животных ”
(1985).
2.2. Методики дослідження
2.2.1. Отримання збагаченої культури моноцитів
Метод отримання гомогенних збагачених культур моноцитів базується на
використанні різниць седиментаційних та адгезивних показників формених
елементів крові. Моношар моноцитів отримували за допомогою метода
фракціонування форменних елементів крові шляхом центрифугування у градієнті
густини з подальшою адгезією моноцитів на склі [244, 245] у нашій модифікації.
Так, замість розчину верографін – фіколл, як градієнт густини використовували
розчин триомбрасту та фіколлу (Швеція “Pharmacia”) (r = 1,077 кг/м3) [244],
адгезію моноцитів до скла проводили у спеціальних інкубаційних камерах [246] у
зволоженій атмосфері з 5% СО2 при t = 37° С впродовж однієї години,
інкубаційною рідиною був розчин Хенкса (ІБОНХ НАН України) з доданим альвезином
“Новый’’(ФРГ “VEB”) в остаточній концентрації 10% [246].
Після інкубації клітини, які не прилипли до скла, змивалися розчином Хенкса при
t = 37°C [244]. Клітини, які залишилися на склі, утворювали моношар для
подальшої роботи.
2.2.2. Кількість цитоплазматичної РНК у моноцитах
РНК у моноцитах виявляли методом люмінесцентної мікроскопії в модифікації
Бертеланфі [247]. Флюорохромовані препарати за методом
- Київ+380960830922