Глава 2. Материал и методы исследования
2.1 Материал исследования
В качестве материала экспериментальной части работы нами были использованы фрагменты седалищного нерва нелинейных белых крыс из вивария Крымского государственного медицинского университета, которых содержали в соответствии с рекомендациями И.П. Западнюка с соавт. Острая алкогольная интоксикация моделировалась на 20 крысах согласно методике В.А. Кононяченко с соавт. [41], в соответствии с которой осуществляли однократное внутрижелудочное введение через зонд 40% водного раствора этанола из расчета 0,04 мл на 1 грамм массы тела экспериментального животного, что составляло 0,016 мл/г чистого этанола. Контрольную группу составляли 20 крыс, которым с целью обеспечения чистоты эксперимента вводили внутрижелудочно 6 мл водопроводной воды.
Хроническая интоксикация этанолом моделировалась посредством ежедневного однократного внутрижелудочного введения 40% водного раствора этанола в количестве 0,015 мл 96% этанола на 1 грамм массы тела экспериментального животного. Экспериментальная группа включала 90 нелинейных белых крыс, из которых 20 были использованы в остром опыте, а 70 для моделирования хронической алкогольной интоксикации. Экспериментальные животные, вошедшие в последнюю группу, были распределены по следующим срокам наблюдения: 7, 14 суток; 1, 3, 6, 9, 12 месяцев. В контрольную группу входили 80 нелинейных белых крыс. При этом животные обеих групп содержались в идентичных условиях, с обеспечением одинакового пищевого и водного рациона, без ограничения подвижности, с раздельным содержанием самцов и самок. Распределение экспериментальных животных по группам наблюдений представлено в таблице 1.
Распределение экспериментальных животных
по группам наблюдений
Таблица 1.
Наименование группКоличество животныхКонтрольная группа80Острая интоксикация этанолом20Хроническая интоксикация этанолом:
7 дней
14 дней
1 месяц
3 месяца
6 месяцев
9 месяцев
12 месяцев
10
10
10
10
10
10
10Всего170
В ходе эксперимента погибло 8 крыс в подопытной и 3 в контрольной группе, указанные случаи не учитывались в исследованиях и изъяты из таблицы 1.
С целью исключения влияния на результаты эксперимента суточных колебаний интенсивности обменных процессов крыс выводили из эксперимента в одинаковое время суток - с 8.00 до 10.00. Забой животных производили методом декапитации без наркоза, рассекали кожу и мягкие ткани бедра и иссекали фрагмент седалищного нерва.
Материалом секционной части работы являлись фрагменты седалищного нерва лиц умерших в условиях острой и хронической алкогольных интоксикаций. Срок взятия материала составлял от 3 до 24 часов после момента наступления смерти. Взятие секционного материала для целей данного исследования производили в отделе экспертизы трупов Крымского республиканского бюро судебно-медицинской экспертизы. Все наблюдения выполнены при непосредственном участии автора.
Отбор, с целью взятия материала, трупов лиц умерших вследствие острой алкогольной интоксикации производили согласно "Методическим указаниям Министерства здравоохранения СССР о судебно-медицинской диагностике смертельных отравлений этиловым алкоголем и допускаемых при этом ошибках" и в соответствии с рекомендациями В.И. Прозоровского с соавт., т.е. при уровне алкоголя в крови 5‰ и более, который считается смертельным [69, 70].
К случаям хронической алкогольной интоксикации относили материал, полученный при исследовании трупов лиц, с диагностированными висцеральными проявлениями алкоголизма (алкогольная энцефалопатия, алкогольный цирроз печени, алкогольная кардиомиопатия и др.), а также имевших достоверный катамнез (нахождение на принудительном лечении по поводу хронического алкоголизма). В контрольную группу нами был включен материал изъятый при вскрытии трупов лиц, смерть которых наступила внезапно как следствие травматических повреждений, а алкоголь в крови не определялся общепринятыми методами. При этом тщательно собирались катамнестические данные. Структура секционного материала представлена в таблице 2.
Распределение секционных наблюдений
по группам
Таблица 2
Группы наблюденияЧисло случаевСодержание алкоголя в крови
(‰)Возраст
(лет)Контрольная группа10-18-40Лица умершие от острого отравления алкоголем
12
5 и выше
20-43Лица умершие на фоне хронической алкогольной интоксикации
21
До 3
25-45
2.2. Методы исследования
После изъятия фрагменты седалищного нерва фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, минимальный срок фиксации составлял 10 дней, в течение которых фиксирующая жидкость сменялась дважды. Фиксатор отмывали в проточной водопроводной воде 24 часа. Кусочки нерва обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% - 1, 96% - 2 и абсолютный спирт), просветляли в бензоле, помещали в парафин при +56?С, с последующей заливкой в смесь парафина и пчелиного воска и приготовлением парафиновых блоков. В ряде случаев использовалась также целлоидиновая техника заливки. Секционный материал обрабатывали аналогичным образом.
Из парафиновых и целлоидиновых блоков готовили срезы толщиной 6 и 10 микрон соответственно, ориентируя блок в двух плоскостях для получения продольных и поперечных срезов нерва.
В связи с быстрым развитием аутолитических процессов, изменением интенсивности и направленности биохимических процессов в нервной ткани, нам не представлялось возможным использовать трупный материал для электронно-микроскопического и гистохимических ферментных методов исследования.
Материал для электронной микроскопии готовили по общепринятой методике: фиксировали на холоде в 2,5%-ом растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере с рH 7,4 с последующей дофиксацией по Millohing 1 % раствором OsO4. После обезвоживания в ацетоне, кусочки седалищного нерва заливали в эпон и помещали в термостат при температуре ?60?С на 48 часов для полимеризаци