РОЗДІЛ 2
МЕТОДОЛОГІЯ І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методи вивчення антигенних властивостей білків та їх взаємодії з клітинами імунної системи
2.1.1. Методи вивчення антигенних властивостей білків.
2.1.1.1. Стратегія епітопного картування білків. Вивчення антигенної будови білків є одним з найбільш актуальних напрямків біоорганічної хімії тому, що ідентифікація епітопів певного білка дозволяє маніпулювати імунною відповіддю на цей білок (розробляти нові синтетичні вакцини, отримувати високопротективні моноклональні антитіла, створювати ефективні імунотоксини, діагностикуми і таке інше) [259]. Епітопом (Т- або В-) називають фрагмент молекули, який розпізнається рецепторами імунних клітин (відповідно Т- або В-лімфоцитів) і стимулює імунну відповідь до себе (синтез специфічних антитіл нащадками В-клітин або проліферацію специфічних Т-лімфоцитів). Таким чином, В-епітоп являє собою експоновану ділянку антигену, з якою безпосередньо зв'язується активний центр антитіла, а Т-епітоп - пептидий фрагмент, представлений для розпізнавання Т-лімфоцитами на антиген-презентуючих клітинах разом з молекулами комплексу гістосумісності [260]. Методи ідентифікації Т- і В-епітопів дещо відрізняються, але в їх основі, як правило, лежить використання фрагментів білка або синтетичних пептидів [261].
Перший класичний метод встановлення антигенної будови білка полягає в імунізації тварин чи культури клітин фрагментами білка або синтетичними пептидами з подальшим визначенням антитіл, специфічних до цілої молекули білка, або проліферації Т-клітин у відповідь на додавання білка in vitro [262]. Перевагою цього методу є можливість виявлення протективних епітопів, які стимулюють імунну відповідь проти нативного білка.
Другий класичний підхід полягає, навпаки, в імунізації тварин цілим білком з подальшим визначенням антитіл, специфічних до фрагментів білка [263], або дослідженням in vitro проліферації Т-лімфоцитів імунізованої тварини у відповідь на додавання фрагментів білка [264].
Ці підходи були значно вдосконалені за рахунок використання панелей моноклональних антитіл та пептидного сканування. Отримання від тварин, імунізованих білком, великої кількості моноклональних антитіл та подальший аналіз їх специфічності за допомогою фрагментів білка дозволяє встановити більшість епітопів. При пептидному скануванні аналізується спектр всіх можливих синтетичних пептидів розміром 7-8 амінокислотних залишків зі зсувом на один залишок. Крім того, за допомогою одиничних замін або модифікації амінокислотних залишків у складі білка або у складі встановленого епітопу можна виявити залишки, що є критичними для імунного розпізнавання.
Існують методи теоретичного передбачення епітопів за допомогою молекулярного моделювання просторової структури білка з відомою амінокислотною послідовністю. Ці методи ґрунтуються на тому, що для епітопів характерні певні загальні особливості, наприклад, В-епітопи, як правило, локалізовані у найбільш експонованих, гідрофільних і рухливих ділянках молекули. Для передбачення антигенної будови білків зараз існує велика кількість комп'ютерних програм [265], в основі яких лежать алгоритми розрахунку профілів гідрофільності [266], рухливості [267], експонованості [268]. Ймовірність правильного передбачення епітопів становить приблизно 50-60% [269]. Тому синтетичні пептиди, що відповідають передбаченим епітопам, перевіряють за допомогою вищезгаданих класичних методів.
Бурхливий розвиток методів молекулярної біології та технічний прогрес, що спостерігаються протягом останніх років, відкривають нові можливості для досліджень антигенних властивостей білків.
Широкого застосування набуває рентгеноструктурний аналіз комплексів Fab-фрагментів антитіл з антигеном [270], а також комплексів білків гістосумісності з антигенним пептидом і Т-клітинним рецептором. [271]. Цей метод дозволяє отримати повну інформацію про склад і конформацію епітопів білка. Особливо перспективним методом встановлення антигенної будови білків зараз вважається мас-спектрометрія [272], а також комбінація афінної хроматографії з мас-спектрометрією [273].
Серед методів молекулярної біології, які починають впроваджуватись, можна виділити, по-перше, технологію імуноскопії, що розроблена на основі полімеразної ланцюгової реакції і дозволяє встановити повний репертуар Т-клітинних рецепторів [274] кожного індивідууму, а по-друге, застосування ДНК-вакцинації для швидкого скринінгу протективних епітопів [275].
Недоліком найсучасніших методів є висока вартість необхідного обладнання або його унікальність. Тому переважна більшість дослідників у всьому світі для вивчення антигенних властивостей білків використовують класичні методи та їх комбінації. Наприклад, нещодавні дослідження антигенних властивостей токсину Helycobacter pillori були проведені з використанням панелі моноклональних антитіл та фрагментованого на субодиниці токсину [276]. Для ідентифікації епітопів ботулінічного токсину А було проведене моделювання просторової структури, синтез передбачених епітопів, перевірка їх взаємодії з моноклональними антитілами, а також перевірка їх імуногенності і протективності для тварин [277]. Пептидне сканування в комбінації з методом амінокислотних замін було використане для вивчення В-епітопів токсинів з отрути скорпіонів [278] і Т-епітопів ентеротоксину В стафілококу [279].
В останні роки з'явилось декілька робіт, присвячених вивченню антигенних властивостей ДТ. Антигенну будову ДТ вивчали за допомогою імунізації мишей передбаченими синтетичними епітопами [188] та за допомогою дослідження специфічності великої панелі моноклональних антитіл до ДТ [192]. Антигенні властивості ДТ у 4 здорових людей, імунізованих дифтерійним анатоксином, вивчали за допомогою фрагментів ДТ [186], а також у 7 здорових людей, імунізованих дифтерійним анатоксином, за допомогою сканування синтетичними пептидами [190].
Проблемою у вивченні антигенних властивостей ДТ є його токсичність, особливо, для людей. Тому у всіх роб