РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1. Біоактивні керамічні матеріали.
В роботі використані зразки біоактивної кераміки, яку було виготовлено на основі гідроксилапатиту науково-виробничим об'єднанням "КЕРГАП" інституту проблем матеріаловедення НАН України:
- гранули ГАП - 80-100 мкм (дрібні) та 400-600 мкм (крупні) з пористістю 15-20% та розміром пор 50-100 мкм;
- пористі (пористість15-25%, розмір пор 150-250 мкм) імплантати на основі 80% гідроксилапатиту та 20% трикальційфосфату (діаметром 4,0 мм та висотою 4,0 мм).
Параметри даних матеріалів повністю відповідають міжнародному стандарту ASTM F 185-88. Наказом МОЗ України №229 від 28.08.96. КЕРГАП введено в Державний реєстр медичних виробів, котрі дозволені до застосування в медичній практиці в Україні за №310/96.
На основі пористих гранул ГАП ("КЕРГАП") та хондроітинсульфату (препарат COLLYRE Lacrypos, лабораторія Alcon S.A., Бельгія) було виготовлено композиційну сполуку. 840 мг гранул ГАП (використовували для оперативного втручання на 10 тваринах) заливали розчином (1 мл) хондроітинсульфату в умовах вакууму при температурі 37оС. Розчин хондроітинсульфату за таких умов проникав у пори ГАП. У 1 мл розчину міститься 30 мг ходроітинсульфату.
Вибір даного препарату пов'язаний з тим, що його фармакологічна активність обумовлена глікозаміногліканом - хондроітинсульфатом. Молекули хондроітинсульфату формують мікрооточення клітин та входять до складу матриксу суглобового хряща. Хондроітинсульфат стимулює синтез хондроцитами протеогліканів та колагену ІІ типу - основних компонентів хрящового матриксу. При зв'язуванні з водою він підвищує еластичні властивості хряща, зменшує деградацію матриксу за рахунок інгібування гіалуронідази та зменшення рівня вільних радикалів.
Препарати на основі хондроітинсульфатів застосовуються при лікуванні ряду захворювань опорно-рухової системи Позитивні результати були отримані при лікування хондроітинсульфатом остеоартрозу суглобів кисті, колінного суглобу та остеоартрозу іншої локалізації [37, 82, 133].
Для створення композитів рекомендують чисті хондроітинсульфати, препарати глюкамiн та хонсурiд. Hа цей час у стоматологічній літературі [18, 19] представлені дані щодо використання керамічних композитів з введенням препаратів на основі глiкозамiноглiканiв, які характеризуються значними репаративними потенціями.
2.2. Методика проведення експериментів на тваринах.
Дослідження виконано у 5-и серіях експерименту на 140-а білих лабораторних щурах лінії Вістар популяції інститут патології хребта та суг-лобів ім. проф. М.І. Ситенка (віком 6 місяців та живою вагою 180(20 г), а також на 15 кроликах (5-а серія експерименту) 3-х місячного віку (живою вагою 2,5(0,15 кг).
1 серія. Контроль - кістково-хрящовий дефект у міжвиростковій ділянці дистального відділу стегнової кістки щурів без будь-якої пластики (35 тварин).
2 серія. Дослід - кістково-хрящовий дефект у міжвиростковій ділянці дистального відділу стегнової кістки з пластикою дрібними гранулами ГАП (розміром 80-100 мкм) - 35 тварин.
3 серія. Дослід - вивчення репаративної регенерації кістково-хрящових дефектів у міжвиростковій ділянці дистального відділу стегнової кістки проводили в умовах пластики крупними гранулами ГАП (діаметр 400-600 мкм) - 35 тварин.
4 серія. Дослід - кістково-хрящовий дефект з пластикою композиційною сполукою на основі гранул ГАП (діаметр 80-100 мкм) з хондроїтин сульфатом - 35 тварин.
5 серія. Дослід - імплантація керамічного композиту (80%ГАП та 20%ТКФ) у кістково-хрящові дефекти у міжвиростковій ділянці дистального відділу стегнової кістки (діаметром 4 мм та глибиною 4 мм) - 5 кроликів (оперували на двох задніх лапах).
Техніка оперативного втручання (рис. 2.1., 2.2.). Під загальним тіопенталовим наркозом в умовах асептики тваринам шляхом бокового доступу відкривали колінний суглоб та зрушували надколінок. За допомогою зубного бору (діаметром 1,5 мм для щурів та 4 мм для кроликів)
Рис.2.1. - Дефект (?) у ділянці епіфізу у міжвиростковій зоні, заповнений керамічним матеріалом
виконували кістково-хрящовий дефект у міжвиростковій ділянці дистального відділу стегнової кістки, на глибину 2 мм та 4 мм відповідно виду тварин.
Дефект у дослідних серіях заповнювали гранулами ГАП, композиційною сполукою на їх основі з хондроітинсульфатом та керамічним блоком на основі 80% ГАП та 20% ТКФ таким чином, щоб імплантований матеріал розташовувався нижче рівня суглобового хряща. (рис.2.1, рис.2.2).
У контрольній групі тварин дефекти залишались незаповненими. Надколінок вертали на місце. Рану пошарно зашивали.
Рис.2.2. Схема розташування керамічного імплантату (К). СХ - суглобовий хрящ, СК - субхондральна кістка
Після проведення операції тварини знаходилися під постійним наглядом.
Експерименти на тваринах проводили відповідно "Правил проведения работы с использованием экспериментальных животных" (за наказом МОЗ СРСР № 724 від 13.11. 1984р.) та правил "Європейської конвенції захисту хребетних тварин, що використовуються у експериментальних і інших наукових цілях" [71].
Евтаназію щурів здійснювали шляхом передозування ефіру через 7, 14, 30, 90 та 180 діб після операції, а кроликів - шляхом введення повітря у вушну вену на 7, 30 та 90 добу після імплантації.
2.3. Методи дослідження.
Застосовані морфологічні методи дослідження з морфометрією площин дефектів та новоутворених тканин разом з імплантованими гранулами ГАП.
Для гістологічних досліджень виділяли дистальний метафіз стегнової кістки та фіксували у розчині з масовою часткою нейтрального формаліну 10%, проводили декальцинацію у розчині з масовою часткою азотної кислоти 4% при температурі 18-22°С, зневоднювали у спиртах зростаючої міцності (70° спирт та двічі 96°) та у спирті з ефіром (розчин 1:1), заключали у целоїдин. Гістологічні зрізи вигот