<p style="font-family: 'Times New Roman', 'Times', serif; font-size: 18px; background-color: #ffffff;"><span style="background-color: #ffffff;">РОЗДІЛ 2 <br />МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ<br /> <br /> 2.1. Характеристика рослинного матеріалу<br /> Об'єктом дослідження була ДНК вегетативних рослин цукрового буряка сорту Білоцерківський однонасінний-45:<br />- 7- 8 - х листків рослин,<br /> - 6-ти денних етіольованих паростків: гіпокотилю разом з сім'ядолями (стебельця) і кореня.<br /> Рослини цукрового буряка вирощували в умовах вегетаційних дослідів (рис.2.1.) у 16-ти кг посудинах з темно-сірим опідзоленим ґрунтом при природному освітленні. <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Рис. 2.1. Вирощування рослин цукрового буряка в умовах вегетаційного досліду.<br /> <br /> В роботі використовувались листки цукрового буряка на різних стадіях їх старіння: С1, С2, С3, С4, С5 - умовно визначених нами, як стадії, на яких відбувається пожовтіння 0-5 %, 5-25 %, 25-50 %, 50-75 % і 75-100 % площі поверхні листка цукрового буряка відповідно. С0 - зелений листок молодої рослини, яка вегетує <br /> Сорт "БО-45" є диплоїдним, урожайно-цукристого напрямку, виведений методом індивідуально-грунтового добору на Білоцерківській дослідно-селекційній станції інституту цукрових буряків ААНУ; більш стійкий до хвороб листків та цвітушності, ніж стандарти [ 107].<br /> Для одержання етіольованих паростків насіння цукрового буряка стерилізували в 30 %-ному перекису водню і пророщували в рулонах фільтрувального паперу, змочуваного дистильованою водою, у термостаті при 25 ?С в темноті протягом 6-ти діб.<br /> <br /> 2.2. Виділення сумарної ДНК<br />2.2.1. Виділення сумарної ДНК за допомогою модифікованого методу Деллапорта <br /> Листові пластинки (без черешків і центральних прожилок), подрібнювали в рідкому азоті, додаючи для зв'язування поліфенолів 5-6 % Polyclar AT і буфер, який складався з 0,1 М трис-HCl (рН 8,2), 0,1 М NaCl, 0,1 M аскорбінової кислоти, 1% ?-меркаптоетанолу, 5% парааміносаліцилової кислоти, 1% діетилдитіокарбамату, 2-3 Ds-Na, 0,05 або 0,1 М ЕДТА.<br /> Одержану гомогенну суспензію інкубували на водяній бані при 70?С 5 хв. Центрифугували на центрифузі "К24D" (Німеччина) при 4 000 об/хв протягом 20 хв. Надосадову рідину депротеінізували сумішшю хлороформ : ізоаміловий спирт (1:24, за об'ємом), яка складала 1/3 від загального об'єму буфера протягом 10 хв. і центрифугували за тих самих умов. Нуклеїнові кислоти осаджували 2,5 об'ємами етанолу або 0,5 - 1 об'ємом ізопропілового спирту протягом ночі при температурі -12 ?С, після чого їх розчиняли у ТЕ-буфері [63] (10 мM трис-HCl (рН 7,4), 1 мM EДТА), вносили NaCl, РНКазу А до кінцевої концентрації 0,5 М і 100 мкг/мл відповідно та інкубували при 37 ?С 1 годину. Потім депротеінізували сумішшю фенол: хлороформ (1:1) і додавали Ds-Na і ацетат калію до кінцевої концентрації 1,1% і 1,2% відповідно, інкубували 30 хв при 0 ?С, центрифугували протягом 5 хв при 10000 об/хв на мікрофузі ?("Beckman", США) двічі. ДНК осаджували 0,5-1 об'ємом ізопропанолу при температурі -12 -18 0С, осад ДНК промивали тричі 70%-ним етанолом і розчиняли у ТЕ-буфері.<br /> Якість препаратів ДНК визначали за спектральними показниками на спектрофотометрі "М-40" ("Сarl Zeiss", Jena).<br /> 2.2.2. Виділення сумарної ДНК сечовино-фосфатним методом та проведення іонообмінної хроматографії на оксіапатиті<br /> Для дослідження особливостей вікових змін ДНК використовувався модифікований нами сечовино-фосфатний метод [218].<br /> Етап 1: рослинний матеріал заморожували рідким азотом, ретельно розтирали і заливали буфером, який містив 1 М NaCl, 0,1 M ЕДТА, 0,03 М або 0,05 М ФБ (ФБ - буфер, який містить еквімолярні розчини NaH2PO4 і Na2HPO4), 0,001 М ЕГТА, 0,1 mM PMSF, 1%-ний Ds-Na. Температуру лізату підвищували до 55-60 ?С та інкубували протягом 5 хв, центрифугували, потім додавали РНКазу А з концентрацією 60-100 мкг/мл та інкубували на протязі 1 год. при 37 ?С. <br /> Етап 2: В інкубаційне середовище при 25 ?С вносили сечовину, NaCl, ФБ, Ds-Na до кінцевих концентрацій, які відповідно дорівнювали 8 М, 1М, 0,03М і 1% та нашаровували на оксіапатит. Оксіапатит промивали спочатку 20 об'ємами (відносно об'єму оксіапатиту) 8М сечовинини, яка містила 0,03М ФБ+1М NaCl, потім послідовно 0,03М ФБ і 0,12М ФБ. Нативну ДНК елюювали 0,4М ФБ при 25 0С і 0,12 М ФБ при 98 0С. <br /> Одноланцюгову ДНК визначали як частку від загальної кількості внесеної ДНК, враховуючи різницю в коефіцієнтах екстинкції одно- та дволанцюгової ДНК [218]:<br /> <br /> А/ (А + В), (2.1)<br /> <br /> де А - кількість одноланцюгової ДНК, <br /> В - кількість дволанцюгової ДНК.<br /> У другому варіанті цього методу листки розтирали у рідкому азоті і лізували у буфері, який містив 0,1 М трис-HCl, рН 8,2, 0,1 М ЕДТА, 0,5 М NaCl, 0,1 M аскорбінову кислоту, 5%-ну парааміносаліцилову кислоту, 1%-ний ?-меркаптоетанол і 1 %-ний діетилдитіокарбамат, 0,001 М ЕГТА, 0,1 mM РМSF, 1 %-ний Ds-Na. Температуру лізату підвищували до 60 0С та інкубували протягом 10 хвилин, потім центрифугували і переосаджували 2,5 об'ємами етанолу. Нуклеїнові кислоти розчиняли у 0,15 М NaCl та додавали РНКазу А з концентрацією 60-100 мкг/мл та інкубували на протязі години при 37 0С. Потім повторювали етап 2.<br /> Концентрацію ДНК вимірювали на спектрофотометрі "М-40".<br /> <br /> 2.3. Термічна денатурація ДНК<br /> Плавлення ДНК проводили на спектрофотометрі СФ-16 (Росія) згідно рекомендацій М. Манделя і Дж. Мармуру [64]. Визначення вмісту гуаніну та цитозину у складі ДНК за допомогою кривих плавлення [62] в 0,1М SSC (0,15 М NaCl + 0,015M цитраті натрію, рН 7,0). Зразки ДНК заздалегідь діалізували відносно вказаних буферів плавлення, до того ж, перша зміна буфера діалізу містила додатково 1М NaCl і 0,001М ЕДТА. Для попередження випаровування на розчин ДНК нашаровували вазелінову олію.<br /> Кількість ГЦ-пар основ розраховували за формулою [ 62, 72]:<br /> <br /> [ГЦ] = 2,44?(Тпл - 81,5 - 16,6 lg M), (2.2)<br /> <br /> де Тпл - температура</span></p>
- Київ+380960830922