ГЛАВА 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Из приведённого обзора литературы видно, что вопросы механизма регенерации тканей после криодеструкции довольно актуальны и всё ещё недостаточно изучены в настоящий момент [8,17,214,280]. Одним из перспективных направлений в этой области является исследование свободнорадикальных процессов в регенерирующей ткани, в основном связанных с перекисным окислением липидов (ПОЛ).
Предполагается, что ПОЛ является одним из факторов, ведущих к развитию патохимии мембран клетки при патологических состояниях [23,110,230]. Нами была поставлена задача исследовать динамику и выявить различия в течении процессов ПОЛ, активности ферментативной антиоксидантной системы в регенерирующих тканях слизистой оболочки полости рта при разнотемпературных воздействиях.
Как правило, ПОЛ традиционно оценивается по скорости и количеству образования первичных молекулярных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ДК) и вторичных - малонового диальдегида (МДА) [123,124].
Учитывая поставленные задачи были проведены экспериментальные исследования и клинические наблюдения. Экспериментальные исследования проводились на базе отдела криобиохимии Института проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины (директор Института - академик НАН Украины, проф. В.И.Грищенко). Клинические наблюдения проведены на кафедре терапевтической и детской стоматологии (зав. каф., д.м.н. проф., В.Ф.Куцевляк) Харьковской медицинской академии последипломного обучения (ректор проф. Н.И.Хвисюк).
2.1. Экспериментальные исследования
Исследование проводилось на 140 белых крысах-самцах линии Вистар весом 200-250 г. Все операции над животными проводили после введения им внутрибрюшинно 0,3 мл тиопентала натрия и наступления наркоза. Животные были разделены на 5 групп:
в первой группе (40 крыс) - животным проводили локальное криовоздействие на слизистую оболочку щеки криотерапевтическим инструментом КАС-01 с помощью парожидкостной струи азота на расстоянии 2-3 мм от поверхности слизистой, игла № 0625, экспозиция воздействия составила 8-10 с. Диаметр охлаждённой зоны составил 6-7 мм при глубине деструкции 0,7-0,8 мм в пределах собственнно слизистой оболочки полости рта, температура в собственно слизистом слое снижалась до -20?С ... -25°С (экспериментальная методика разработана на кафедре терапевтической стоматологии ХМАПО, В.А. Никитин, К.В. Григорьева) [39,176].
во второй группе (40 крыс) в тех же условиях проводили локальную диатермокоагуляцию с помощью диатермокоагулятора стоматологического ДКС-2М нагревом тканей до температуры 95-110°С высокочастотным разрядом мощностью 0,6-0,8 Вт и частотой 110 кГц в течение 10 с. Диаметр зоны коагуляции - 5-7 мм, глубина - 0,7-0,8 мм.
в третьей группе (40 крыс) в тех же условиях проводили комбинированное воздействие на слизистую оболочку полости рта крыс (предварительная криообработка слизистой (4-6с), а затем - диатермокоагуляция) [77,81];
в четвёртой группе животных (20 крыс), начиная со вторых суток после проведенной криодеструкции, под эфирным наркозом применяли водно-солевой экстракт плаценты "Плацентек" [183] в виде аппликаций с экспозицией 15-20 мин. в течение 3-4 дней.
пятая группа являлась контрольной.
Животных выводили из эксперимента на 1, 3, 10 и 21 сутки для биохимического исследования динамики процессов регенерации.
Для изучения механизмов регенерации слизистой оболочки полости рта нами проведены сравнительные биохимические, морфологические и иммунные исследования метаболических процессов в тканях слизистой оболочки полости рта крыс после локальной криодеструкции, диатермокоагуляции и их сочетанного воздействия, криодеструкции с последующим применением "Плацентека".
Изучена динамика изменения интенсивности ПОЛ в гомогенатах ткани у животных в эксперименте по концентрации МДА и ДК, а также по максимумам интенсивности спонтанной и люминолиндуцированной ХЛ (табл.2.1). Также оценивали состояние ферментативной антиоксидантной системы по изменению активностей ферментов группы глутатиона ГП и ГР. Провели гистологическое, гистохимическое, морфометрическое исследование материала, дифференцировку иммунных клеток в очаге поражения.
Таблица 2.1
Материалы и методы экспериментального исследования
Процессы
ПОЛМетодики воздействия на слизистую оболочку полости рта крысКриодеструкцияДиатермокоагуляцияКомбинированное воздействиеОпределение концентрации МДА
Определение концентрации ДК
Уровень спонтанной ХЛ
Уровень ХЛ с люминоломАктивность
антиоксидантной
системы
Определение активности ГР
Определение активности ГПСтруктурное и
иммуноморфологическое
исследование
Гистологическое исследование
Гистохимическое исследование
Иммуноморфологическое исследование (с помощью моноклональных антител)
Гистостереометрия
2.1.1. Исследование процессов перекисного окисления липидов
а) определение концентрации малонового диальдегида. Иссекали участки поражения диаметром 1,5?1,5 см в пределах видимо здоровых тканей, затем гомогенизировали навеску в холодном фосфатном буфере рН 7,4 (с добавлением ингибитора протеаз PMSF - фенилметилсульфонилфлуорид) с помощью ручного стеклянного гомогенизатора.
Определение МДА велось модифицированным методом (Э.Н. Коробейникова, 1983, 1989гг.) [123], в основе которого лежит реакция МДА с тиoбарбитуровой кислотой (ТБК), дающая при высокой температуре и кислой среде окрашенный комплекс [285]. Для проведения реакции 0,1 мл гомогената вносили в среду инкубации, содержащей 0,3% раствор ТБК и 8% раствор трихлоруксусной кислоты с 0,5N HCl, затем, после перемешивания, образцы подвергали нагреву в кипящей водяной бане в течение 10 мин.
Измерение экстинции проводили на спектрофотометре СФ-16 при 532 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Концентрацию МДА рассчитывали по калибровочному графику.
б) методик