ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальное исследование проведено на 216 беспородных белых крысах самцах двух возрастных групп: неполовозрелых и репродуктивного возраста (1 и 5 месяцев от рождения, с исходной массой 50-55 г и 180-200 г). Распределение подопытных животных по сериям представлено в таблице 2.1.
Таблица 2.1
Распределение экспериментальных животных по сериям
ВозрастСерияКоличество животных7 дней15 дней30 дней60 днейНеполовозрелыйК6666Ф16666Ф26666Б6666С6666РепродуктивныйК6666Ф16666Ф26666С6666Всего216
Животные обеих возрастных групп были разделены на серии в зависимости от использованного препарата. В сериях Ф1 и Ф2 представлены животные, получавшие фенобарбитон в дозах 30 и 70 мг/кг соответственно. Среди неполовозрелых крыс выделена серия животных Б, которым вводили 35 мг/кг бензонала. Контролем (К) для этих серий служили животные получавшие дистиллированную воду из расчета 10 мл/кг. Серию С составили животные, которые на фоне введения 30 мг/кг фенобарбитона получали силибор в дозе 80 мг/кг массы тела животного. Все препараты вводились ежедневно в виде суспензии на дистиллированной воде при помощи желудочного зонда.
Выбор использованных в работе препаратов не случаен: фенобарбитон - наиболее широко применяемый в клинической практике препарат этой группы лекарственных средств. Что касается бензонала, то в последнее время проводится изучение преимуществ и недостатков (по терапевтической эффективности и выраженности побочных действий) этого препарата в сравнении с фенобарбиталом. Дозы препаратов выбраны как наиболее часто используемые в научных исследованиях [19, 66].
В эксперименте использованы препараты следующих фирм-производителей: "Elegant India" - фенобарбитон, Казанского производственного химико-фармацевтического объединения "Татхимфармпрепараты" - бензонал и харьковской фармацевтической фирмы "Здоровье" - силибор. Все медикаменты приобретены на Луганском областном коммунально-производственном предприятии "Фармация".
Постановка эксперимента осуществлялась в соответствии с Правилами проведения работ с экспериментальными животными [60]. Все животные содержались в стандартных условиях вивария. В ходе эксперимента проводились наблюдения за динамикой массы тела подопытных животных каждые 10 дней. При ежедневном наблюдении за общим состоянием и поведением животных отклонений не выявлено.
По истечении сроков эксперимента (через 7, 15, 30 и 60 дней) животных декапитировали под эфирным наркозом. Проводили скелетирование, освобождая от мягких тканей большеберцовую, плечевую, тазовую кости и третий поясничный позвонок. Кости взвешивали на аналитических весах ВЛА-200 с точностью до 1 мг и измеряли штангенциркулем с точностью до 0,05 мм. Программа остеометрии для длинных трубчатых костей включала показатели наибольшей ширины проксимального и дистального эпифизов, передне-заднего размера середины диафиза, максимальную длину кости и ширину середины диафиза; в плоских и губчатых костях измеряли максимальную длину, ширину и толщину [169].
Для гистологического исследования брали фрагменты проксимального эпифиза и середины диафиза большеберцовой кости, которые фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировали в 5% растворе муравьиной кислоты, обезвоживали в спиртах возрастающих концентраций и толуоле, заливали в парафиновые блоки. Парафиновые гистологические срезы толщиной 6-8 мкм окрашивали гематоксилин-эозином. Микроморфометрическое исследование срезов диафиза и проксимального эпифизарного хряща большеберцовых костей осуществляли с помощью окулярного винтового микрометра МОВ-1-15х ГОСТ 7865-56 и окулярной измерительной сетки микроскопа МБИ-3 [1]. Калибрование измерительных устройств осуществляли миллиметровым отрезком ГОСТ 7513-55.
Морфометрию эпифизарного хряща проводили по следующей программе: общая ширина эпифизарного хряща, ширина его индифферентной, пролиферирующей и дефинитивной зон в отдельности. С помощью 100-точечной измерительной сетки определяли процентное соотношение клеточных элементов и межклеточного вещества эпифизарного хряща; долю первичной спонгиозы. Перечень морфометрических показателей срезов диафизов в себя включал: общую ширину диафиза, ширину слоя наружных генеральных пластин, ширину остеонного слоя, ширину слоя внутренних генеральных пластин, диаметр остеонов и их каналов.
Химическое исследование костей состояло из определения процентного взаимоотношения между органической и неорганической частями кости, ее влагонасыщенностью процентно-весовым методом по разнице в весе нативной, высушенной до постоянного веса в сухожаровом шкафу при температуре 105°С и озоленной в муфельной печи при температуре 450-500°С в течение 12 часов кости [80]. Полученную золу растирали в фарфоровой ступке и хранили в герметических микропробирках.
Для исследования макроэлементного состава костей 5 мг костной золы растворяли в 2 мл 0,1 Н химически чистой соляной кислоты и доводили объем раствора дистиллированной водой до 25 мл. Содержание кальция, калия и натрия определяли методом спектрометрии на пламенном фотометре ПАЖ-3. Содержание фосфора находили колориметрическим методом с использованием электрофотоколориметра "Мефан-1008". Исследование проводилось в полном соответствии с инструкциями к этим препаратам.
Биомеханические параметры костей исследовали на универсальной разрывной машине Р-0,5 со скоростью нагружения 0,25 мм/мин до разрушения. Рассчитывали удельную стрелу прогиба, предел прочности, модуль упругости и работу разрушения [96].
Данные, полученные в результате исследования, обрабатывались с использованием методов вариационной статистики. Достоверной считали вероятность ошибки менее 5% (р<0,05).
При помощи компьютерной программы, разработанной диссертантом в соавторстве [59], осуществлены корреляционный и регрессионный анализы.
Данная программа разрабатывалась в среде T