РОЗДІЛ 2
ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота виконувалась протягом 1997-2000 рр. в лабораторії бактеріології Інституту ветеринарної медицини УААН, Центральній лабораторії ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України та Херсонській державній біологічній фабриці.
2.1. Матеріали і методи
Матеріалом для досліджень були капсулоутворюючі (Bac.anthracis ІВМ 97Z)та безкапсульні вакцинні штами збудника сибірки : 55 ВНИИВВиМ (Росія), 34F2 (Англія), К-79Z (Україна) та окремі види сибіркоподібних мікроорганізмів Bac. cereus, Bac. anthracoides, Bac. subtilis [33]. У проведенні дослідів також використовували преципітуючу сибіркову сироватку (ТУ 46.21.956-76), та антиген сибірковий стандартний, виготовлений Тобольською біофабрикою (Росія). Для вирощування мікробів застосовували рідкі (МПБ, бульйон Хоттінгера, середовище 199, 5%-вий гемогідролізат для культури тканини) та тверді агарізовані поживні середовища з різними добавками (дріжджовий екстракт, екстракт печінки, глюкоза тощо).
Кількість мікробних клітин в інокуляті з суспензії кожного штаму, взятого у дослід, складало окремо 0,5; 1,0; 3,0 млн. мікробних клітин 24-годинної агарової культури (МПА) на 1 см3 рідкого поживного середовища. Вирощування мікробів проводили у флаконах об'ємом 250 і 500 см3, в які наливали 200,400 см3 середовища. Засіви вирощували в термостаті при 37?С протягом 24 і 36 годин.
Після закінчення інкубації кількість мікробних клітин у культуральній рідині визначали за допомогою стандарту мутності на 10 одиниць та підрахунком кількості колоній, що виросли на МПА бактеріологічних чашок після посіву 0,1 см3 культуральної рідини.
Наявність рухливості у видів, що досліджувались, визначали візуально мікроскопією мазків "роздавлена крапля" та посівом уколом у напіврідкий м'ясо-пептонний агар.
Гемолітичні властивості сибіркових і окремих сибіркоподібних бацил вивчали методом посіву бактеріальної суспензії на кров'яний (5%) МПА та МПБ.
Наявність гемолітичних властивостей у екзотоксину сибіркових мікробів вивчали шляхом внесення 1-2% еритроцитів барана в пробірку з стерильним фільтратом культуральної рідини з титром екзотоксину 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256. Засіви інкубували в термостаті при 380С 24 години. Кількісні і якісні показники визначали у трьох повторностях дослідів.
Культуральну рідину з продуктами метаболізму сибіркових і сибіркоподібних спороутворюючих мікроорганізмів отримували за загально прийнятою технологією [86,87,88,158], та за методом авторського свідоцтва № 1022362 [7].
Рідке живильне середовище заливали в колбу, засівали необхідною кількістю мікробних клітин і вирощували в термостаті або в термальній кімнаті при 370С протягом 24 або 36 годин, в нерухомому стані або періодичному струшуванні на шуттель-апараті, чи перемішуванні з допомогою магнітної мішалки. Отриману культуральну рідину фільтрували через стерілізуючу керамічну свічку марки F5 з розміром пор 2,5 нм. В стерильному фільтраті визначали наявність та кількість (титр) екзотоксину за реакцією преципітації (Асколі, диск-преципітації).
Отримання екзотоксину таким способом має свої недоліки: неможливо уникнути руйнування клітин мікробів під час струшування, перемішування чи від виснаження живильного середовища, та забруднення фільтрарату групоспецифічними соматичними антигенами. Крім того, під час маніпуляції з культуральною рідиною вірулентних штамів збудника сибірки не виключена небезпека контакту дослідника з вірулентним мікробом.
З цих причин для отримання культуральної рідини сибіркових мікробів, максимально звільнених від соматичних антигенів та захисту дослідника, ми користувались методикою А.І. Завірюхи, О.М Харчука [7]. Цей метод дозволяє працювати не тільки з вакцинними, але й з польовими вірулентними штамами збудника сибірки і не боятися зараження дослідника. Вирощування мікробів відбувається у закритій системі, у потоці культуральної рідини, з одночасовою її стерилізацією.
Суть методу у наступному. Для отримання культуральної рідини, максимально звільненої від антигенів соми клітин, ми користувались спеціальним пристроєм (рис. 2.1), який складається з резервуару для поживного середовища (1), крана для регулювання швидкості витіку з нього середовища (2), інкубаційної камери (3) (керамічна свічка поміщена в кожух, який забезпечує стерильність фільтрату), канюль для заправки системи середовищем, суспензію мікробів досліджувальної культури та регуляції тиску у середині системи (4), та флакона-накопичувача для збирання стерильного фільтрату (5). Вся система монтується в термостаті, де підтримується стабільна температура 370С на протязі всього терміну вирощування. Після закінчення вирощування мікробів у стерильному фільтраті, зібраному у флаконі-накопичувачі, визначали кількість специфічного сибіркового білку (екзотоксину) за методом реакції диск-преципітації [10]. Для виконання цієї реакції готували відповідну систему та робили ряд розведень фільтрату (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256).
а. Оригінал б. Схема
Рис.2.1 Пристрій для вирощування мікробів в потоці культуральної рідини.
Примітки:
1. Резервуар для живильного середовища;
2. Кран для регулювання швидкості витіку;
3. Керамічна свічка поміщена в кожух, який забезпечує стерильність
фільтрату;
4. Захисний кожух;
5. Флакон-накопичувач для збирання стерильного фільтрату;
6. Повітряні фільтри.
Виготовлення системи. На дно чистої бактеріологічної пробірки вносили 0,5-1,0 см3 преципітуючої сибіркової сироватки, яка може бути не відстояна, не фільтрована і не прозора, як того вимагає методика постановки реакції Асколі. По стінці пробірки на сироватку нашаровували, за допомогою пастерівської піпетки, розплавлений і охолоджений до 41- 45?С 1%-вий агаровий гель, виготовлений із якісного сорту (наприклад агар Діфко ), або ж спеціально очищеного агару [10,114]. О