Профілактика та лікування звичного невиношування вагітності у жінок з автоантитілами до хоріонічного гонадотропіну людини

Розділ 2
Матеріали та методи дослідження
Робота виконана на протязі 1997–2002 років в Донецькому регіональному центрі
охорони материнства та дитинства (ДРЦОМД) — генеральний директор доктор
медичних наук, професор Чайка В.К. Лабораторні дослідження проводилися в
центральній науково-дослідній лабораторії Донецького державного медичного
університету ім. М. Горько­го, а також в лабораторії ДРЦОМД.
Дослідження проводили в два етапи. На першому етапі — плануван­ня вагітності —
ми обстежували жінок із ЗНВ з метою виявлення причин даної патології. На
другому етапі нами були обстежені жінки із звичним невиношуванням під час
вагітності, що знаходилися на стаціонарному лікуванні у відділенні патології
вагітності № 2 та кабінеті по лікуванню невиношування вагітності.
На першому етапі було проведено обстеження 580 жінок, які в анамнезі мали
перинатальні втрати, з них у 282 (48,6 %) було ЗНВ неясного генезу. У 75
(26,6 %) жінок із ЗНВ були виявлені автоантитіла до ХГЛ.
Розроблена схема обстеження, яка включала вивчення анамнестич­них даних і
клініко-лабораторні дослідження.
Далі було проведено поглиблене обстеження жінок із ЗНВ і наявністю автоантитіл
до ХГЛ поза та на протязі вагітності.
Під час вагітності пацієнткам проводилося обстеження в термінах до 5 тижнів
вагітності, 8–10, 12–14, 20–24 і 32–36 тижнів. Дослідження в дані терміни
гестації ми вважали найбільш доцільними, тому що рівень авто­антитіл до ХГЛ на
протязі вагітності змінюється хвилеподібно відповідно коливанню рівня ХГЛ у
сироватці крові з відставанням на 2–3 тижня. За літературними даними
спостерігаються три характерні збільшення рівня автоантитіл (Ig M і G) до ХГЛ у
8–14, 20–24 і 32–36 тижнів вагітності [60, 105]. В свою чергу зміни
концентрації ХГЛ у сироватці крові жінок під час вагітності носять нелінійний
характер [31, 49, 80, 107, 125, 134].
При фізіологічному перебігу вагітності у терміні 8–10 тижнів відмічається
перший «пік» екскреції ХГЛ, у цьому же терміні відмічається найвища частота
серцебиття плода (169 уд/хв), найменша маса тіла жінок, зниження артеріального
тиску, зменшення вмісту циркулюючого гемо­глобіну та об’єму циркулюючої крові
[31]. З 13–14 до 17–18 тижнів спостерігається виражене зниження рівня ХГЛ, а з
19 по 24 — концентрація гормону, залишається приблизно на одному рівні. В 34–36
тижнів відмічається другий, значно менший «пік» ХГЛ [31].
Таким чином, у зв’язку із збігом «піків» екскреції ХГЛ і автоантитіл до ХГЛ, ми
проводили дослідження саме в ці терміни гестації.
Клініко-лабораторне дослідження включало дослідження гормональ­ного,
імунологічного, гемостазіологічного статусів пацієнток та функціо­нального
стану плода.
Імунний статус оцінювали за показниками:
Т-клітинного імунітету та його субпопуляцій; В-клітинного імунітету;
гуморальної ланки імунітету; антитіл до ХГЛ класів Ig M і G.
Кількість Т- і В-лімфоцитів та їх основних субпопуляціый (хелперів/ індукторів
та супресорів/цитотоксичних клітин) досліджували за допомо­гою прямої
імунофлюоресценції із застосуванням комерційних наборів моноклональних антитіл
фірми ORTHO Diagnostics systems (США). Іденти­фікували лімфоцити з фено­типами
CD3+ (тотальна популяція Т?клітин), CD4+ (Т?хелпери/індуктори), CD8+
(Т?супресори/цитотоксичні клітини), CD16+ (натуральні кілери), CD22+
(В?лімфоцити). Розраховувався імуно­регуляторний індекс CD4+/CD8+ як
співвідношення регуляторних субпо­пуляцій мононуклеарів. Лунки парафільму,
прикріпленого на предметному склі, заповнювалися по 20 мкл полі-L-мізином в
концентрації 50 мкг/мл. Через 30 хвилин інкубації при температурі 37°С в лунки,
відмиті двічі в середовищі 199 вносилася суспензія клітин, що досліджувалася
(по 20 мкл) в концентрації 1 ґ 106/мл, через 45 хвилин інкубації (37С°) до
осаду лімфоцитів, попередньо звільнених від над­осадової рідини, додавалися
відповідні моноклональні антитіла (по 20 мкл). Інкубація тривала ще 30 хвилин
при температурі 20°С, після чого іммобілізовані клітини відмивали тричі
середовищем 199. До лунок вносили 50 % гліцерин, накривали їх покривним склом і
за допомогою люмінісцентного мікроскопу «Люмам–1» враховували наявність
флюо­ресценції мембран 200 клітин.
Функціональна активність В-лімфоцитів характеризується рівнем не­специфічних
імуноглобулінів у сироватці крові. Вміст Ig G, A, M ви­значався за методом
радіальної імунодифузії [231] з використанням відповідних антисироваток
виробництва Московського НДІ вакцин та сироваток ім. І.І. Мєчникова. Рівень ЦІК
визначали за допомогою полі­етіленгліколю МВ 6000, розчиненого у боратному
буфері [56]. В пробірки вносили по 0,38 мл розведеної сироватки крові. В першу
(контроль) додавалося 4 мл боратного буферу, в другу (дослід) — 4 мл розчину
поліетиленгліколю. Вміст пробірок ретельно перемішували і інку­бували 60 хвилин
при температурі 20–22°С. Оптична щільність вимірю­валася на спектрофотометрі в
кварцових кюветах (1 ґ 1 см) при довжині хвилі 450 нм.
Гемолітичну активність комплементу визначали за 50 % гемолізом уніфікованим
методом.
Автоантитіла до ХГЛ Ig M і G визначали в сироватці крові за методом
імуноферментного аналізу з використанням високоочищеного препарату ХГЛ
(«Sigma», США), змішаних моноклональних антитіл (МКАТ) до в-субодиниці ХГЛ
(Москва) та кон’югат МКАТ проти імуно­глобулінів людини класів M і G з
пероксидазою хріну (Інститут вакцин і сироваток ім. Гамалєї, Москва).
Препарат гормону використовували в концентрації 6 000 МЕ/л, сиро­ватки, що
досліджували у розведенні 1 ч 100, кон’югати проти Ig M і G людини відповідно у
розведенні 1 ч 100 000 і 1 ч 50 000.
Очищений антиген (хоріонічний гонадотропін)