РОЗДІЛ 2
МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕННЯ
2.1. Постановка досліду і об’єкт дослідженнь
Досліди проведені на 169 щурах-самцях популяції Вiстар, середньої маси 130-180
г. Під час експериментів тварини перебували на напівсинтетичному раціоні, що
забезпечує надходження оптимальних кількостей незамінних нутрієнтів.
Раціон тварин. З'ясування специфічної дії антиоксидантів є досить складним
завданням, оскільки звичайні раціони віварію відрізняються значною
нестабільністю вмісту мiкро- та макронутрiентiв, що ускладнює контроль за
надходженням нутрієнтів. Тому в дослідженні був використаний напівсинтетичний
раціон, який дозволяє контролювати кількість нутрiєнтiв, що надходять у
організм тварин.
Під час дослідів тварини отримували напівсинтетичний раціон, складений за
рекомендаціями, викладеними в монографії "Эксперимен-тальная витаминология".
Раціон складався з казеїну та крохмалю у співвідношенні 20 та 65%. До складу
раціону входили також 5% лярду, 5% соняшникової олії. Дієта включала також 1%
суміші вiтамiнiв, 3% суміші солей та 1% целюлози. Всі компоненти ретельно
перемішувались з 2,5 літрами води та заварювались при повільному нагріванні.
У складі суміші вітамінів на 1 кг корму припадало вiтамiнiв: рибофлавіну - 10
мг, тіаміну - 4 мг, пантотенової кислоти - 20 мг, нiацину - 25 мг, пiридоксину
- 10 мг, фолату - 2 мг, біотину - 0,2 мг, вітаміну К - 3 мг, цiанкобаламiну -
0,03 мг, ретинолу – 2000 МЕ, кальцiферолу - 0,05 мг, токоферолу - 100 мг,
iнозитолу – 100 мг, аскорбінової кислоти - 500 мг, холіну - 100 мг,
пара-амiнобензойної кислоти - 50 мг.
Сольова суміш містила макро- та мікроелементи (на 1 кг корму - 30 г суміші).
Склад суміші: натрію хлорид - 58,5 г, калій фосфорнокислий однозамiщений -
163,3 г, магнiю сульфат - 24,1 г, кальцію карбонат - 160,2 г, заліза сульфат -
11,1 г, калію йодид - 0,322 г, марганцю сульфат - 1,87 г, цинку сульфат - 0,23
г, міді сульфат - 0,20 г, калію хлорид - 0,03 г, натрію фторид - 0,21 г,
алюмокалієві галуни - 0,047 г.
Введення антиоксидантів та гепатотоксинів. Селеніт натрію вводили в дозі 30
мкг/кг (в перерахунку на селен) внутрішньоочеревинно протягом 5 днів. Ця доза
приблизно в 5 разів переважає добову потребу щурів в селені. За даними
T.Juszkiewicz [1993], селеніт натрію навіть в дозах 1000 та 2000 мкг/кг не
викликає токсичних явищ. Мексидол вводили перорально протягом 7 днів в дозі 50
мг/кг. Ця доза найбільш часто використовується при проведенні експериментальних
досліджень і запозичена нами з літератури. Дибунол вводили перорально в дозі 50
мг/кг протягом 7 днів. Ця доза дибунолу та близькі до неї дози широко
використовуються в експериментальних дослідженнях [15].
Парацетамол вводили тваринам перорально двічі з інтервалом в один день в дозі
2,5 г/кг маси щура. Аліловий спирт вводили перорального один раз в дозі 100
мг/кг (1 мл 1% водного розчину на 100 г маси тварин). Використані нами дози
гепатотоксинів є типовими і широко застосовуються для моделювання токсичних
уражень печінки [15, 32, 117]. Парацетамол вводили щурам протягом двох останніх
днів з початку насичення тварин антиоксидантами, а аліловий спирт – вводили в
останній день введення антиоксидантів. Умови досліду представлені на таблиці
2.1.
В іншому варіанті досліду оцінка гепатотоксичності парацетамолу та алілового
спирту та гепатопротекторні властивості селеніту натрію, дибунолу та мексидолу
досліджувались на ізольованих гепатоцитах щурів. Тваринам, що знаходились на
повноцінному раціоні протягом 5 днів вводили селеніт натрію (30 мкг/кг по
селену), або протягом 7 днів дибунол (50 мг/кг) чи мексидол (50 мг/кг). Після
цього щурів декапітували і отримували ізольовані гепатоцити за відомим
колагеназним методом Сеглена.
Таблиця 2.1
Схема експериментів по визначенню гепатопротекторної дії антиоксидантів in vivo
Групи щурів
Дні експерименту
1-3 дні
4 день
5 день
6 день
7 день
Інтактні, n=17
Парацетамол, n=24
Селеніт натрію +
парацетамол + n= 9
Дибунол +
парацетамол, n=9
Мексидол +
парацетамол, n=6
Аліловий спирт, n=25
Селеніт натрію +
аліловий спирт, n=9
Дибунол +
аліловий спирт, n=9
Аліловий спирт + мексидол, n=6
Примітка: знак + означає введення речовин щурам
Життєздатність клітин оцінювали по їх профарбовуванню трипановим синім, виходу
лактатдегідрогенази в позаклітинну рідину, зниженню вмісту відновленого
глутатіону при інкубації гепатоцитів з 2,5 мМ парацетамолом на протязі 120 хв,
чи 1,0 мМ аліловим спиртом. Активність лактатдегідрогенази (КФ 1.1.1.27)
оцінювали по зниженню поглинання NADH [18].
Інгібування мікросомальних ферментів викликали введенням тваринам
універсального інгібітора ферментів цитохрому Р450, оскільки кобальта хлорид
активуючи гемоксигеназу, викликає руйнування гемової частини цитохромів [249,
250]. Кобальта хлорид вводили в дозі 10 мг/кг внутрішньоочеревинно двічі з
інтервалом в 1 день, останнє введення за добу перед отриманням гепатоцитів.
Піразол інгібітор алкогольдегідрогенази [130] вводили перорально в дозі 50
мг/кг за 1 годину перед отриманням ізольованих гепатоцитів печінки. Дисульфірам
вводили перорально в дозі 100 мг/кг за 24 години перед отриманням ізольованих
гепатоцитів. Дисульфірам є потужним інгібітором як альдегіддегідрогенази [202]
так і таких ізоформ цитохром Р450, як CYP2E1, 2C9, 2C19, 2D6, and 3A4 [100,
102].
Методи визначення активності ферментів та вмісту речовин. Для отримання
субклiтинних фракцій печінки щурів, що напередодні голодували протягом 12 год.
(без обмеження води), декапітували під
- Київ+380960830922