Ви є тут

Загальна активність нейтральних протеїназ, активність кальпаїнів та a-2-макроглобуліну при оксидативному стресі у щурів

Автор: 
Самохін Андрій Олександрович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2003
Артикул:
3403U001176
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Постановка експерименту
У роботі використовували щурів-самців лінії Wistar 3-місячного віку, вагою
180-220 г, що утримувались у стандартних умовах віварію Харківського
університету.
Визначення досліджуваних показників проводили в сироватці крові та гомогенатах
тканин серця, легень, печінки та нирок щурів, які були одержані після осадження
ядер та незруйнованих клітин. Тварини були розподілені на групи в залежності
від мети експерименту:
Тварини, яким вводили одноразово внутрішньочеревинно хлорид кобальту (СоСl2
6H2O) у 0,9 % розчині NaCl з розрахунку 3 мг на 100 г маси тіла тварин [205].
Тварин декапітували через 30 хв, 2 год, 24 год та 4 доби після введення хлориду
кобальту.
Тварини, яким вводили одноразово внутрішньочеревинно хлорид ртуті в 0,9 %
розчині NaCl у розрахунку 0,7 мг на 100 г маси тіла [206]. Тварин декапітували
через 30 хв, 2 год, 24 год та 4 доби після введення хлориду ртуті.
Тварини, яким вводили відповідний об’єм фізіологічного розчину (контрольні
тварини).
Тварини, яким за 2 год до введення хлоридів кобальту та ртуті вводили
внутрішньочеревинно розчин пентоксифіліну в розрахунку 15 мг на 100 г маси тіла
[207]. Тварин декапітували через 2 год, після введення хлоридів ртуті чи
кобальту.
Тварини, яким вводили внутрішньочеревинно розчин пентоксифіліну в розрахунку 15
мг на 100 г маси тіла. Тварин декапітували через 2 год, після введення
препарату.
Тварини, яким вводили одноразово внутрішньочеревинно циклогексимід в 0,9 %
розчині NaCl у розрахунку 0,2 мг на 100 г маси тіла [208]. Тварин декапітували
через 2 год, після введення циклогексиміду.
Тварини, яким за 2 год до введення циклогексиміду внутрішньочеревинно вводили
розчин пентоксифіліну в розрахунку 15 мг на 100 г маси тіла. Тварин
декапітували через 2 год, після введення циклогексиміду.
Тварини, яким за 2 год до введення хлориду кобальту вводили перорально водний
розчин кверцетину в розрахунку 10 мг на 100 г маси тіла [209]. Тварин
декапітували через 2 год, після введення хлориду кобальту.
2.2. Одержання гомогенатів органів
Після декапітації черевну порожнину тварин розтинали, печінку перфузували
охолодженим фізіологічним розчином. Тканини легень, серця, печінки та нирок
гомогенізували в Na-фосфатному буфері рН 7,4 в гомогенізаторі Поттера на льоду.
Отримані гомогенати центрифугували 10 хв при 5000 g на центрифузі РС-6 при
4° С.
2.3. Визначення загальної активності нейтральних протеїназ
Загальну активність нейтральних протеїназ визначали ферментативним методом, що
базується на використанні в якості субстрату протеолітичної реакції комплексу
маркерного ферменту та субстратного білка імобілізованого на поверхні
полістиролу [210].
В якості субстратного білка використовували сироватковий альбумін бика, а в
якості маркерного ферменту – пероксидазу з хрону. Оцінку рівня активності
протеїназ проводили за залишковою активністю маркерного ферменту по відношенню
до ортофенілендіаміну в присутності перекису водню. Якщо субстратом є
біополімер, де фермент атакує більше ніж один хімічний зв’язок, то замість
виразу “мікромоль субстрату” рекомендують користуватися поняттям
“мікроеквівалент задіяних хімічних зв’язків [211]. Враховуючи те, що субстратом
був комплекс двох білків ми розраховували активність в мікроеквівалентах
задіяних хімічних зв’язків за хв. Для побудови калібрувального графіку
використовували серію розведень трипсину, за концентрацією якого визначали
мікроеквівалент задіяних хімічних зв’язків, оскільки певній концентрації
трипсину відповідала певна кількість маркерного ферменту, що залишився на
полістиролі після інкубації. Комплекси маркерного ферменту з субстратним білком
отримували методом метаперйодатного окислення за Курмановою [212]:
Окислювали молекули пероксидази – 4 мг ферменту розчиняли в 1 мл дистильованої
води, додавали 0,2 мл 0,1 М свіжевиготовленого розчину метаперйодату натрію та
інкубували на протязі 20 хв в темряві.
Діалізували протягом ночі проти дистильованої води при 4 оС.
До окисленої пероксидази додавали 0,8 мл розчину альбуміну (8мг) та 0,2 мл 0,2
М карбонат-бікарбонатного буферу рН 9,5. Через 2 год реакцію зупиняли
додаванням 0,1 мл (0,4 мг) свіжевиготовленого розчину борогідриту натрію,
витримували 2 год при 4 оС.
Діалізували протягом ночі проти фізіологічного розчину. Після діалізу кон’югати
розводили гліцерином (1:1) та зберігали при
- 20 oС.
Визначення загальної активності нейтральних протеїназ проводили в такій
послідовності:
Імобілізували утворений комплекс на поверхні полістиролових плашок шляхом
висушення із розчину 0,5 М бікарбонату амонію. Відмивали дистильованою водою з
0,05 % твін-20 для видалення комплексів, які не імобілізувалися на плашці.
Проводили протеолітичну реакцію: досліджувані зразки вносили в лунки
полістиролової плашки з імобілізованим комплексом, у контрольні зразки вносили
розчини трипсину, за якими будували калібрувальний графік. Інкубували при 37 oС
протягом 15 хвилин.
Продукти реакції усували відмиванням дистильованою водою з твін-20 (0,05 %).
Визначали залишкову активність маркерного ферменту. Для цього готували суміш,
яка містила ортофенілендіамін (2 мг), пергідроль (2 мкл) у 10 мл 0,1 М
цитратному буфері, pH 4.5-4.6 і вносили її в лунки плашок по 100 мкл.
Зупиняли реакцію додаванням 50 % сірчаної кислоти.
Визначали оптичну густину контрольних і дослідних зразків за допомогою
багатоканального мікроспектрофотометра «Flow» при 492 нм.
Розраховували активність протеїназ по розщепленню субстрату за формулою:
С ґ 1000
––––––––––– мікроекв