РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнялась в лаборатории биотехнологии отдела генетики и биотехнологии
Селекционно-генетического института - Национального центра семеноводства и
сортоизучения УААН (далее СГИ) и в лаборатории культуры тканей Южного
биотехнологического центра в растениеводстве УААН и МОН в 1996-2001 годах.
Использованы яровые сорта ячменя Hordeum vulgare L.: Адапт, Галатея, Гелиос,
Мишка, Одесский 100, Одесский 115, Пивденный, Сталкер, Golden promise. Данные
сорта, представляющие определённый интерес в практической селекции,
предоставлены отделом селекции и семеноводства ячменя СГИ. В наших
экспериментах каждый сорт был представлен потомством одного семени. В работе
также использовалась серия изогенных по генам морфологических признаков линий
сорта Одесский 100, созданная научным сотрудником отдела генетики и
биотехнологии СГИ к.б.н. Г.П. Бондарем. Описание линий приведено в таблице
2.1.
Основным объектом исследований служила культура незрелых зародышей и пыльников
ячменя. Растения-доноры незрелых зародышей выращивали на опытных полях СГИ в
1996-2000 г.г. В осенне-зимний период растения выращивали в климатических
камерах при 16-часовом фотопериоде, освещённости 18-20 тыс. люкс и суточном
температурном режиме +22...25°С днём и +18...20°С ночью.
Отбор незрелых зародышей проводили на 10-15 день после опыления, когда их
размер достигал 1-2 мм. До высадки эксплантов срезанные колосья при
необходимости хранили в холодильнике при +4°С.
Зерновки стерилизовали в насыщенном растворе гипохлорита кальция в течение 30
минут, затем 10 минут выдерживали в 0,01 н растворе HCl и пятикратно промывали
стерильной дистиллированной водой.
Незрелые зародыши размером 1-2 мм помещали в асептических условиях в химические
стаканы высотой 10 см и диаметром 2,5 см с 10 мл агаризованной среды для
индукции каллуса (агар 8 г/л), по 5-6 зародышей на стакан, щитком к питательной
среде. Стаканы закрывали стерильной фольгой или синтетической плёнкой.
Культивирование зародышей проводили в темноте при +25°С ± 2°С.
Таблица 2.1
Изогенные линии сорта Одесский 100
Фенотип
Гены-маркеры и их локализация
Шестирядность, безлигульность
v (хромосома 2), li (2)
Шестирядность, глянцевый стебель и колос
v (2), gs3 (2)
Шестирядность, широкая цветковая чешуя
v (2), log1 (2)
Жёлтая полосатость листьев
yst2 (3)
Шестирядность, гладкие ости
v (2), r (7)
Фуркатность
K (4)
Короткие ости
ari-a12 (4)
Некротическая пятнистость листьев
nec1a (5)
Тёмный перикарп, оранжевая лемма
B (5), o (6)
Среда для индукции каллуса (MS) содержала минеральные и органические элементы,
состав и концентрация которых предложены T. Murashige и F. Skoog [159], 30 г/л
сахарозы, 16 мг/л 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и 1 г/л гидролизата
казеина. Для изучения влияния состава питательной среды на индукцию каллуса
использовали модификации данной среды с добавлением 16 мг/л ИУК
(Я-индолил-3-уксусная кислота), ХФУ (хлорфеноксиуксусная кислота), ИМК
(Я-индолил-3-масляная кислота), а также питательную среду Гамборга B5 [160] с
добавлением 30 г/л сахарозы, 16 мг/л 2,4-Д и 1 г/л гидролизата казеина.
Через 28 дней, после удаления побегов, образовавшие каллус экспланты переносили
на среду MS, содержавшую 6 мг/л 2,4-Д, 1 мг/л ХФУ, 30 г/л сахарозы и
культивировали в течение 3-4 недель на рассеянном свету интенсивностью 2-3 тыс.
люкс, 16-часовом фотопериоде и температуре +25°С ± 2°С. Затем каллусы помещали
для регенерации на среду MS с добавлением 0,5 мг/л зеатин-рибозида, по 200 мг/л
пролина и глутамина. Все питательные среды стерилизовали автоклавированием при
0,8 атм в течение 20 мин. Перед пересадкой на среду для регенерации проводили
учёт каллусов с видимыми участками роста, формировавших побеги или плотный
светлый вторичный каллус на своей поверхности (морфогенные каллусные культуры).
Рыхлые некротизирующиеся каллусы считали неморфогенными.
Для генетического анализа признака “регенерация растений” в культуре незрелых
зародышей провели скрещивание по диаллельной схеме сортов Одесский 115, Гелиос,
Golden promise и фуркатной линии сорта Одесский 100. Кастрацию и принудительное
опыление осуществляли по стандартной методике. Генетический анализ проводили по
методикам I.L. Jinks [161], B.I. Hayman [162, 163] в изложении М.А. Федина с
соавторами [164] и П.П. Литуна и Н.В. Проскурина [165]. Определение типов
эффектов генов по признакам “длина проростка” и “регенерация растений” на
основании средних потомств F1, F2, B1, B2, полученных от скрещивания сорта
Гелиос и фуркатной линии сорта Одесский 100, проводили по методу взвешенных
наименьших квадратов [166].
Для получения более оправданных статистических показателей провели
2arcsinЦp-трансформацию полученных данных частоты регенерации, где р – число
регенеративных каллусных культур в % от общего числа каллусов; выраженные в мм
показатели длины проростков были предварительно log-трансформированы.
Ожидаемые величины гетерозиса по исследуемым признакам расчитывали по формуле
`F1-`P1 = [h]-[d] или `F1-`P1 = ([h]+[l])-([d]+[i]), в зависимости от
генетической модели, адекватной полученным данным [166].
Статистическую обработку данных и генетический анализ осуществляли с помощью
программы Excel 7.0 из пакета программ Microsoft Office для IBM PC.
Растения-доноры пыльников выращивали в полевых условиях в 1997-1998 г.г., а
также в камере “Ilka” при освещённости 20-25 тыс. люкс, длине светового для 16
часов и температуре +13°С. Для изоляции пыльников использовали колосья с
микроспорами на средней и поздней одноядерной стадии