РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Культивування штамів поліовірусів
У роботі було досліджено вакцинні та дикі референс-штами поліовірусів 1
(LSc2ab, Mahoney), 2 (P712Ch2ab, MEF-1) та 3 (Leon12a1b, Saukett) типів,
отримані з Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М.П. Чумакова
РАМН, а також 237 штамів поліовірусів, виділених на кафедрі мікробіології,
вірусології та імунології НМУ ім. О.О. Богомольця та в СЕС у різних регіонах
України протягом 1994-1999 років.
Згідно з розпорядженням ВООЗ, колекція диких штамів поліовірусів 1, 2 і 3 типів
30 жовтня 2001 року була передана у депозитарій Регіональній
референс-лабораторії ВООЗ із поліомієліту (м. Москва, РФ).
Дослідження референс-штамів поліовірусів здійснювали з використанням культури
клітин НЕр-2с, у той час, як пасажі та типування вірусних ізолятів проводили на
двох лініях клітин - НЕр-2с та RD - згідно з рекомендаціями ВООЗ [21]. Маточні
культури клітин вирощували в 0,5-літрових флаконах з використанням середовища
RPMI-1640 або DMEM і додаванням пеніциліну (150 од/мл). До зазначених середовищ
додавали ембріональну телячу сироватку (ЕТС) до 5-7% вмісту. Клітини інкубували
на боковій стінці 0,5-літрових флаконів у термостаті при температурі 37оС із
пасажами через 2-4 доби, залежно від початкової густини посадки. Необхідну
концентрацію СО2 підтримували шляхом герметичного закупорювання флаконів або
використовували СО2-інкубатор (Jouan, Франція) із концентрацією СО2 5%. Клітини
знімали зі скла, обробляючи моношар 0,02% розчином Версену (у випадку лінії
НЕр-2с) або 0,02% розчином Версену з додаванням 0,25% трипсину (у випадку лінії
RD) і розсаджували при густині суспензії 40-100 тис. клітин/мл.
Накопичення вірусних ізолятів здійснювали в 10-20 мл пеніцилінових флаконах.
Для цього моношари клітин, вирощених на боковій стінці флаконів, інфікували 0,2
мл вірусовмісного матеріалу, додавали 3 мл середовища підтримки (MEM чи DMEM)
та інкубували у термостаті в нахиленому становищі при 36оС. Флакони щоденно
перевіряли на появу ЦПД, застосовуючи інвертований мікроскоп «Біолам П-1». За
наявності щонайменше 70-80% ЦПД флакони з вірусами піддавали заморожуванню та
подальшому розмерзанню для вивільнення вірусних часток.
Титр вірусів визначали за ЦПД у культурах клітин НЕр-2с. Для цього
використовували стерильні 96-лункові планшети та середовище МЕМ або DМЕМ із
додаванням 2-4 % ЕТС. На кожне десятикратне розведення брали 4 або 8 лунок.
Кожне з розведень вірусу вносили в об`ємі 50 мкл, після чого додавали по 50 мкл
середовища і по 100 мкл клітинної суспензії у концентрації від 100 до 150
тисяч/мл. Планшети інкубували у СО2-інкубаторі, облік результатів здійснювали
на 4-6 добу. Отримані результати статистично обробляли за методом Кербера.
Ідентифікація поліовірусів
Приналежність виділеного штаму до певного типу поліовірусу встановлювали у РВН
із застосуванням поліклональних антитіл до поліовірусів 1, 2 і 3 типів,
отриманих з ВООЗ (Женева, Швейцарія). Ці антитіла готували до роботи за
прикладеною до них інструкцією у вигляді наступних діагностичних сумішей: суміш
I (містить антитіла до поліовірусів 1, 2 і 3 типу), суміш II (антитіла до 1 і 2
типів), суміш III (антитіла до 1 і 3 типів) і суміш IV (антитіла до 2 і 3
типів). Приготовлені суміші антитіл розливали по 1 мл у маленькі пробірки з
кришкою і зберігали при –20оС. РВН проводили відповідно до рекомендацій ВООЗ
[21], використовуючи 96-лункові планшети.
Внутрішньотипову диференціацію поліовірусів здійснювали за допомогою панелі
МКАТ, отриманої на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології
Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, під керівництвом
проф. В.П. Широбокова [24, 200], а також МКАТ, люб`язно наданих у наше
розпорядження д-ром R. Crainic (Інститут Пастера, Париж, Франція) [25].
Характеристика МКАТ. Активність та диференціююча здатність МКАТ визначалася в
РВН та оцінювалася за допомогою індексу нейтралізації (NI). Значення NI
обраховувалося за формулою [25]:
NI = lgVTa – lgVTp,
де VТa – титр вірусу без антитіл; VTp – титр вірусу в присутності антитіл.
За абсолютними значеннями NI визначали активність МКАТ, а про здатність
диференціювати вакцинний та дикий штам судили за різницею в значеннях NI. При
аналізі диференціюючої здатності отриманих МКАТ визначали NI для багатьох
розведень культуральних рідин із використанням вакцинного та дикого
референс-штамів поліовірусів. Паралельно титрували кожний з вірусів без
антитіл. Статистичну обробку отриманих результатів здійснювали за методом
Кербера. Для визначення оптимальної зони диференціювання штамів будували
графіки залежності NI від розведення антитіл. Одержавши дані щодо розведення
антитіл, проводили дослідження штамів поліовірусів, виділених на території
України за 6 років (1994-1999 рр.), у РВН із МКАТ кафедри мікробіології,
вірусології та імунології та МКАТ (10, I0, 20, IIa, 30), наданих д-ром R.
Crainic.
Таким чином, диференціацію поліовірусів 1 типу здійснювали з МКАТ АН8, 1Е6, 10
(специфічні до LSc2ab) та I0, 7C2 (специфічні до Mahoney); поліовіруси 2 типу
диференціювали з МКАТ 1Н11, 3D2, 1D11, 7A2, 4G11, 8B11, 20 (специфічні до
P712Ch2ab) та IIa (специфічне до MEF-1); диференціацію поліовірусів 3 типу
проводили з МКАТ 9B5, 5D3 і 30 (специфічні до Leon12a1b). Постановку РВН із
МКАТ здійснювали в стерильних 96-лункових планшетах. Для кожної культуральної
рідини, що містила МКАТ, брали два ряди лунок планшета. У кожну лунку вносили
по 50 мкл МКАТ у робочому розведенні, потім у кожні чотири лунки додавали по 50
мкл одного з десятикратних розведень досліджуваного вірусу. Паралельно
титрували
- Київ+380960830922