Вы здесь

Трансгеномні (Brassica napus+B.nigra) та трансгенні (Orychophragmus violaceus) рослини родини хрестоцвітих

Автор: 
Сахно Людмила Олександрівна
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2003
Артикул:
0403U001562
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика вихідного матеріалу
Як вихідний матеріал для проведення експериментів використовували:
1) насіння ярого ріпаку (Brassica napus L. var. oleifera DC.) сортів
Мар’яновський, Ковалевський і Калинівський та озимого сорту Федорівський
селекції Національного Аграрного Університету, люб’язно надане проф.
Пересипкіним В.Ф.
2) насіння гірчиці чорної (Brassica nigra L.) К-2656 (Канада).
3) насіння дикого виду Orychophragmus violaceus (L.)O.E.Schulz. (Китай).
2.2. Вирощування рослин в асептичних умовах
Для отримання асептичних рослин, що використовувались в експериментах, насіння
стерілізували, послідовно занурюючи його в 70% етанол (1 хв), діоцид (10 хв),
стерильну воду (тричі по 10 хв). Насіння пророщували на безгормональному
середовищі Мурасіге і Скуга [229] в чашках Петрі в темряві при 28°С. Після 5–7
діб паростки переносили в стерильні колби з тим же середовищем. Всі рослини
вирощувались в термальній кімнаті при 24°С і освітленні 4000 –5000 люкс.
2.3. Виділення і культивування протопластів
2.3.1. Виділення і культивування протопластів ріпаку Brassica napus L.
Для виділення протопластів ріпаку використовували гіпокотилі 5–7-добових
етиольованих проростків. Гіпокотилі нарізали на сегменти довжиною 1–2 мм в
Таблиця 2.1
Середовища для культивування та регенерації протоклонів ріпаку, мг/л
Компонент
ShB1
ShB3
ShB4
ShB12
NB2
NH4Cl
267,5
267,5
267,5
54
267,5
KNO3
1900
1900
1900
380
1900
CaCl2Ч2H2O
440
440
440
440
440
MgSO4Ч7 H2O
370
370
370
74
370
KH2PO4
170
170
170
170
170
Мікросолі, Fe-хелат
MS
MS
MS
MS
MS
Мезоінозіт
100
100
100
100
100
РР
В1
10
10
10
В6
2,4-Д
0,1
НОК
0,1
Кінетін
0,1
БАП
0,4
0,2
Глютамін
100
100
Гидролізат казеіну
500
500
300
Дріжджовий екстракт
100
100
Глюкоза
7280
7280
Ксилоза
250
250
Сахароза
1000
2000
3000
Гліцин
Агар “Difco”
0,7%
Агароза “Chemapol”
0,4%
ферментній суміші, яка складалась з 0,3% Onozuka R–10 (Yakult Biokemicals,
Японія), 0,2% Cellulysine (Calbiochem, США), 0,2% Macerase (Calbiochem, США) і
0,1% Dricelase (Kyowa Hakko, Японія) в сольовому середовищі W5 [230], яке
містило 154 мкМ NaCl, 125 мкМ CaCl2Ч2H2O, 5мкМ KCl, 5мкМ глюкози, рН 5,6.
Стерилізацію ферментної суміші проводили фільтруванням через мембранні фільтри
Millipore (США) з розміром пор 45мкм. Ферментацію проводили 12–16 год у темноті
при 26°С. Кожна проба для ферментації содержала приблизно 0,5 г тканин на 10 мл
ферментного розчину.
Після ферментації суспензію фільтрували у центрифужну пробірку через сито з
діаметром пор 60–100 мкм, після чого центрифугували 7 хв при швидкості
обертання ротору 1000 об/хв. Протопласти осідали на дно пробірки. Осад
ресуспендували у 7 мл розчину 0,5М сахарози, нашаровуючи 1–2 мл середовища W5.
Знов центрифугували при тій же швидкості 3 хв. Протопласти, що флотували на
межі двох середовищ, збирали за допомогою пастерівської пипетки в окрему
пробірку разом з середовищем W5. Туди ж додавали 5–7 мл свіжого середовища W5,
ресуспендували і центрифугували 1,5–2 хв при 700 об/хв. Відмивку у середовищі
W5 проводили двічі. Перший етап культивування протопластів проводили на
середовищі ShB1 (табл.2.1), мінеральна основа та вміст вітамінів якого
відповідали середовищам Shepard [231], а гормональний склад - середовищам
Glimelius [25], у темноті при 26°С. Щільність висіву була 104 – 105
протопластів/мл.
2.3.2. Виділення і культивування протопластів Brassica nigra L. та
Orychophragmus violaceus (L.)O.E.Schulz.
Для виділення протопластів гірчиці чорної і Orychophragmus violaceus
(L.)O.E.Schulz. використовували листя асептичних рослин, які росли на
безгормональному середовищі 3–4 тижня. За допомогою леза листя нарізали на
вузькі смужки (не більш, ніж 1–2 мм шириною) і клали на поверхню ферментної
суміші у чашки Петрі. Суміш складалася з 0,3% Onozuka (Yakult Biochemicals,
Японія) і 0,3% Macerozyme (R-101, Serva, США) у розчині 0,4М сахарози.
Ферментацію і очистку протопластів проводили способом, подібним вище описаному
за виключенням першого етапу. Культивування протопластів O.violaceus
Таблиця 2.2
Середовища для культивування протоклонів O. violaceus
Макро- та мікросолі,
вітаміни
Гормони
Модифікація
2,4-Д
НОК
БАП
Кін
ІОК
SW
0,2
0,5
SW1
SW
0,2
SW2
SW
0,2
0,5
SW3
SW
0,5
SW4
SW
0,5
SW5
PCN
0,3
0,1
PCN1
PCN
0,3
0,5
PCN2
PCN
0,3
PCN3
PCN
0,1
PCN4
Km8p
0,1
0,5
Km8pmod
Km8p
0,1
0,1
Km8p1
Km8p
0,5
0,1
Km8p2
Km8p
0,5
Km8p3
Sh
0,1
0,4
ShB1
починали на середовищі SW1 [15], (табл.2.2), щільність висіву була 104–105
протопластів/мл.
2.4. Гібридизація протопластів
Експерименти по злиттю протопластів проводили за методикою Menczel et al.
[232]. Протопласти для дослідів отримували з двох об’єктів незалежно. Після
відмивки від ферменту проводили подвійне інактивування протопластів:
гіпокотильні (ріпак) обробляли 10 мМ розчином йодацетаміду в середовищі W5 20хв
при 4°С, мезофільні (гірчиця чорна) - опроміненням g-променями в дозі 500 Гр
(джерело - Со60, 0,1 Гр/сек). Після обробки протопласти змішували у
співвідношенні 1:1, суміш розкапували по дну пластикової чашки Петрі. Об’єм
кожної краплі становив 0,2 мл. Після 15 хвилин (час, потрібний для осідання
протопластів) на краплю наносили 0,1 мл розчину,