Ви є тут

Антигенна структура білків оболонки двох українських штамів М-вірусу картоплі

Автор: 
Ткаченко Тетяна Юріївна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2003
Артикул:
0403U002102
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МЕТОДОЛОГІЯ І ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Основні підходи до визначення вірусних епітопів

2.1.1. Методи встановлення вірусних епітопів
Основні підходи до локалізації вірусних епітопів та білкових епітопів загалом не відрізняються. Деякі відмінності пов'язані зі специфікою об'єкта: біологією вірусу та структурою вірусної частки.
Для локалізації епітопів на білкових АГ застосовується декілька основних підходів [87, 89, 166], які підсумовані в таблиці 2.1. Одним з основних методів визначення так званих структурних епітопів, а також дослідження їх просторових параметрів є рентгеноструктурний аналіз (РСА). Він надає інформацію про комплекс антиген-антитіло як про статичний об'єкт, іншими словами, дозволяє фіксувати один з етапів динамічного процесу взаємодії макромолекул [167-169]. Наприклад, РСА комплексу нейрамінідази вірусу грипу с Fab-фрагментом специфічного антитіла ?170? показав, що епітоп нейрамінідази переривчастий та складається з 4 поверхневих петель, побудованих приблизно з 15 амінокислотних залишків, які контактують з паратопом антитіла. Контактом вважають зближення атомів менше ніж на 4 A. Виходячи саме з цієї вельми довільної величини були одержані такі результати: структурний епітоп формують 15-22 амінокислотних залишки, площа його дорівнює - 700-900 A2. Використання геометричного критерію для оцінки того, чи відноситься даний залишок до епітопу, не дає інформації про його внесок в енергію взаємодії з антитілом. Цю інформацію можна одержати за допомогою методів визначення так званих функціональних епітопів.
Таблиця 2.1
Методи локалізації епітопів
МетодТип епітопуСередня кількість залишків в епітопі1) Рентгеноструктурний аналіз комплексу антиген - Fab фрагмент антитілаКонформаційні епітопи, які взаємодіють з гомологічними антитілами15-222) Вивчення перехресних реакцій між пептидом та антитілами до білка (вірусу)Лінійні епітопи, які перехресно реагують з гетерологічними антитілами3-83) Вивчення перехресних реакцій між білком (вірусом) і антитілами до пептидуЛінійні епітопи, які перехресно реагують з гетерологічними антитілами3-84) Визначення критичних амінокислотних залишків в пептиді шляхом їх послідовної заміни іншими залишкамиЛінійні епітопи, що перехресно реагують та містять критичні амінокислотні залишки, які перемежовуються залишками, що безпосередньо не беруть участі в реакції3-55) Вивчення перехресної реактивності між гомологічними білками або білками, які містять точкові мутаціїКонформаційні епітопи1-36) Аналіз вірусних мутантів, які уникають нейтралізаціїЕпітопи нейтралізації7) Топографічне епітопне картування при аналізі конкурентного зв'язування моноклональних антитілВизначення розташування епітопів відносно один одного
Одним із найбільш розповсюджених методів локалізації епітопів в вірусних білках є аналіз здатності АТ проти вірусу перехресно реагувати з пептидами, що відтворюють послідовність вірусного білка [171]. В класичному варіанті, який було запропоновано Атассі [172], аналізувалися пептиди, одержані після розщеплення молекули білка. В сучасних методах більш широко використовують синтетичні пептиди. Якщо пептид взаємодіє з антивірусним АТ, то вважають, що він містить лінійний епітоп вірусного білка. Втім, через те, що пептиди зазвичай слабко реагують з антивірусними АТ, можна припустити, що вони являють собою не лінійний епітоп, а частину більшого конформаційного епітопу. Виключенням з цього правила є пептиди, що відтворюють N- та С-кінцеві фрагменти поліпептидного ланцюга. Вони демонструють набагато більшу перехресну реактивність, ніж інші пептиди. Це може бути пов'язано з тим, що N- і С-кінцеві фрагменти вірусного білка часто експоновані на поверхню віріону та більш рухливі, ніж внутрішні ділянки амінокислотного ланцюга.
При тестуванні пептидів на антигенну перехресну реактивність принциповими є їх довжина [109] та обраний для аналізу варіант імунохімічного аналізу [173]. Коли пептиди знаходяться в розчині, а не адсорбовані на твердому носії, збільшується ймовірність того, що вони набудуть необхідної для взаємодії з антитілом конформації ?174?. Іноді навпаки, антибілкові антитіла краще розпізнають пептиди, що кон'юговані з білком-носієм або адсорбовані на твердій фазі ?109?; в даному випадку мікрооточення пептиду на поверхні носія може сприяти формуванню необхідної для взаємодії з антитілами конформації пептиду.
Гейзен [175] розробив зручний метод для синтезу та тестування великої кількості синтетичних пептидів (метод пептидного сканування - пепскан). Метод полягає в одночасовому синтезі сотень пептидів на спеціальних поліетиленових носіях. Формат носія дозволяє тестувати пришиті до носія пептиди в ІФА. Через те, що пептиди після аналізу можуть бути вивільнені від антитіл ультразвуком, їх повторне тестування різними антитілами можна проводити до 30 разів. Метод широко використовується для систематичного дослідження антигенної перехресної реактивності всіх можливих пептидів, які складаються з 6-10 амінокислотних залишків та послідовно перекриваються. Крім того, метод дозволяє визначати роль окремих залишків у взаємодії пептидів з антитілами. В цьому випадку для аналізу синтезують пептиди, де кожну амінокислоту послідовно замінено на іншу (одну з 19 можливих) [176].
Модифікація методу Гейзена, яку запропонували Рода та Трібік [177], дозволяє одержувати в розчинах синтетичні пептиди різної довжини у великій кількості, зокрема біотинильовані пептиди для аналізу взаємодії з антитілами, а також пептиди для використання в афінній хроматографії.
Для визначення вірусних епітопів корисним інструментом є антитіла, одержані проти синтетичних пептидів - аналогів фрагментів вірусного білка [178]. Якщо антипептидні антитіла взаємодіють з інтактним вірусним білком, то вважають, що цей пептид відповідає лінійному епітопу. Крім того, в такий спосіб можна отримати антитіла до ділянок, які не викликають синтезу антитіл при імунізації нативним білком. При імунізації тварин пептиди, які коротше, ніж 10-15 амі