ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Способ получения органной культуры коры надпочечных желез
В соответствии с основной целью работы в лаборатории тканевых культур Института
эндокринологии и обмена веществ (зав. - проф. И.С.Турчин) с нашим участием был
разработан оригинальный метод получения органной культуры коры надпочечных
желез человека и животных (А.С. №1377291 СССР, МПК 4 С 12 N 5/00 Способ
получения клеток коры надпочечников человека и животных / И.С. Турчин, Н.Д.
Тронько, Д.С. Онищенко, И.С. Челнакова, А.В. Тищенко, Р.М. Сичинава; Киевский
НИИ эндокринологии и обмена веществ.- №4026680/28-13; Заяв. 20.12.85; Опубл.
29.02.88; Бюл. №8, 1988.- С.66.).
Исходным материалом были надпочечники плодов человека 16-23 недельного
возраста, новорожденных суточных поросят, взрослых свиней, надпочечники,
удаленные у взрослых лиц с болезнью Иценко-Кушинга. Процедура слагается из
нескольких этапов.
2.1.1. Получение исходного материала.
Ниже описана методика получения ксенокультуры из коры надпочечников
новорожденных поросят, т.к. она практически почти полностью вытеснила
использование других видов культур по причинам, о которых будет сказано ниже.
Выращивание культуры из надпочечников плодов человека или взрослых лиц
методически полностью идентично.
Поросят суточного возраста забивают гильотинированием. Экстирпацию
надпочечников осуществляют с соблюдением правил асептики и антисептики. Забитое
животное моют несколько раз в теплой проточной воде и укладывают на правый бок.
Кожу нижней части грудной клетки живота и спины просушивают тампоном и дважды
обрабатывают 2,5%-ным спиртовым раствором иода. Рассекают и отсепаровывают
изогнутыми ножницами кожу с подкожно-жировой клетчаткой в следующих границах:
справа - до края позвоночника, вниз - до уровня гребешка подвздошной кости,
слева - до средней линии живота, кверху - до уровня VIII-IX ребер. Другим
комплектом инструментов в области левой почки вскрывается брюшная полость и
вырезается сегмент брюшины. Подрезают и отодвигают влево селезенку, туда же
смещают поджелудочную железу и кишечник. С медиальной стороны верхнего полюса
почки рассекается паранефральная жировая клетчатка и из нее выделяется
надпочечник, который удаляют. Животное поворачивают на левый бок и процедуру
повторяют. Оба надпочечника после удаления немедленно помещаются в охлажденный
(4оС) 0,25%-ный раствор гидролизата лактальбумина, в который добавляется
кристаллический пенициллин из расчета 100 ед. на 1 мл.
2.1.2. Изготовление органной культуры коры надпочечников.
Используются два способа, которые существенно не отличаются друг от друга.
1) Надпочечные железы тщательно очищаются от жира и мозгового вещества и
измельчаются на фрагменты размерами до 0,5-1,0 мм. Их тщательно отмывают
раствором Хенкса или средой 199 до получения прозрачной жидкости, переносят во
флаконы емкостью 250 мл, заливают питательной средой и помещают в холодильник
(4оС) на 12 - 14 часов. После указанного срока заменяют питательную среду новой
и культуру помещают в термостат (37оС). Соотношение: объем ткани : питательная
среда = 1 : 6-7.
2) Надпочечники обрабатывают вышеописанным способом. Ткань помещают во флаконы
емкостью 250 мл и заливают смесью следующего состава: среда 199 – 80 мл,
инактивированная бычья сыворотка 20 мл, 100 ед/мл пенициллина. Рh среды
доводится 5%-ным раствором бикарбоната натрия до 7,2. Флаконы помещают в
холодильник (4оС) на 12 - 14 часов. Затем содержимое флакона, не сливая среды,
подогревают на водяной бане до 32оС. Перемешиванием на магнитной мешалке
проводят трипсинизацию (дезагрегацию) 2 раза по 15 мин с промежуточной заменой
предложенной среды. Надосадочную жидкость сливают, а ткань 5 - 6 раз отмывают
средой 199 и помещают в питательную среду.
2.1.3. Выращивание культуры коры надпочечников (культивирование).
Культуры коры надпочечных желез выращивают в термостате при 36оС. Для удобства
приготовления препаратов, морфологического, гистохимического,
ультраструктурного исследования в посуду, где культивируется суспензия,
помещают кусочки слюды типа “Мусковит” размерами 20ґ5 мм. Первую замену
питательной среды производят через 16 - 18 часов; все последующие - в
зависимости от Рh, в среднем каждые 3 суток.
Органную культуру выращивают во флаконах 250 - 500 мл. Повышению ее
морфофункциональных свойств способствует культивирование при вращении флаконов
со скоростью 2 об/мин, в специально приспособленных аппаратах для
культивирования клеток. Качество органных культур оценивают путем приготовления
в различные сроки культивирования срезов с выращиваемых фрагментов для световой
и электронной микроскопии и определения в питательной среде содержания
ІІ-оксикортикостероидов.
Органная культура считается пригодной для трансплантации через 5 - 7 суток от
начала культивирования. По завершении этого срока культура отделяется от
питательной среды, промывается физиологическим раствором (36оС), переносится в
стерильные флаконы или ампулы и доставляется в клинику. В сопроводительном
направлении указывается вид культуры, дата изготовления, количество исходного
материала, сведения о стерильности, гормональной активности, дата выдачи.
2.2. Клиническая характеристика больных и методы исследований
В настоящей работе приведены сведения о 138 больных с хроническим
постадреналэктомическим гипокортицизмом, которые лечились методом
трансплантации органных культур коркового вещества надпочечных желез в
хирургической клинике Института эндокринологии та обмена веществ АМН Украины. В
эту группу входили 115 женщин и 23 мужчин в воз
- Київ+380960830922