раздел 2.3.4). К 2,5 мл исследуемого гидролизата, после доведения его рН до 8,0 0,1н раствором NaOH, добавляли 6 мл 0,2М пирофосфата натрия (рН 8,0) и 1,4 мл свежеприготовленного 0,2М раствора хлорамина Б. Смесь тщательно перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 20 минут. Затем реакцию окисления останавливали, добавляя 6 мл 3,6М раствора тиосульфата натрия, после чего добавляли 4 мл 1М раствора трис-HCl буфера (рН 8,0), затем последовательно вносили в раствор избыток сухого NaCl и 10 мл сцинтилляционного толуола. Пробы интенсивно встряхивали в течение 3 минут, и после расслоения толуоловой и водной фаз верхний толуоловый слой, содержащий радиоактивный пролин, тщательно отсасывали. Оставшуюся водную фазу, содержащую радиоактивный продукт окисления 3Н-оксипролина, прогревали в кипящей водяной бане 20 мин для превращения промежуточного продукта окисления оксипролина в пиррол. К охлажденным пробам добавляли 12 мл толуола и смесь встряхивали в течение 3 минут, как и в первый раз. После расслоения фаз отсасывали 10 мл толуольной фазы, содержащей радиоактивный пиррол.
Для определения радиоактивности пролина и оксипролина к 10 мл исследуемых элюатов добавляли по 5 мл втрое сконцентрированного толуольного сцинтиллятора.
Счет радиоактивности производили на счетчике Beckman LC 7800 (США).
Об интенсивности синтеза коллагена в органах судили по удельной радиоактивности 3Н-оксипролина, которую рассчитывали в имп/мин отнесенных к мг коллагена.
2.3.7. Определение степени гидроксилирования остатков пролина в коллагене
О степени гидроксилирования пролина в свежесинтезированном коллагене типа I, выделенном диализом из экстракционного раствора (разд. 2.3.3) судили по отношению доли радиоактивного оксипролина к общей радиоактивности иминокислот. Полученную величину выражали в процентах [25].
2.3.8. Аналитическое определение тирозина
Метод основан на способности тирозина образовывать окрашенные соединения с реактивом Фолина [39]. Для проведения цветной реакции к 0,4 мл нейтрализованного гидролизата добавляли 2 мл смешанного реактива, который готовили следующим образом: к 2% раствору калий-натрий виннокислого добавляли равный объем 0,1% раствора CuSO4, после чего к одной части полученной смеси добавляли 50 частей 2% раствора Na2CO3 в 0,1 н растворе NaOH. После 10-минутного выдерживания при комнатной температуре к образцам добавляли 0,2 мл стандартного реактива Фолина, разбавленного в 2,7 раза. Пробы тщательно перемешивали и через 30 минут производили измерение оптической плотности на КФК-2МП при длине волны 750 нм в кюветах толщиной 0,5 см. Содержание тирозина определяли по калибровочному графику, для построения которого использовали тирозин фирмы "Reanal" (Венгрия).
2.3.9. Электрометрическое определение Са2+
Определение содержания Са2+ в моче проводили потенциометрически с применениям ионселективного электрода [29]. В 10 мл отфильтрованной пробы помещали электроды: ЭВЛ-1М4 с электрическим ключом, заполненным 0,01М раствором NaCl, и ЭМ-Са-01, заполненный 0,001М раствором СаCl2. Через 2 мин после тщательного перемешивания проводили измерение (в мВ) на ионометре рН-150.
Содержание Са2+ в мг/л определяли по калибровочному графику, построенному по стандартному раствору CaCl2 (4 мг Са2+ в 1 мл водного раствора).
2.3.10. Флюориметрический метод определения 11-оксикортикостероидов в плазме крови
Метод [67] основан на способности 11-оксикортикостероидов (11-ОКС) вступать в реакцию с концентрированной серной кислотой с образованием флюоресцирующих продуктов. Свечение максимально при возбуждении светом с длиной волны 470 нм, максимальная флюоресценция соответствует 530 нм.
Данный метод включает обезжиривание, депротеинизацию плазмы крови, экстракцию 11-ОКС метилхлоридом, очистку экстракта, последующую экстракцию стероидов спиртово-сернокислотным реактивом и измерение интенсивности флюоресценции в сравнении с соответствующим стандартом.
К 4 мл исследуемого раствора, содержавшего от 0,2 до 2 мл плазмы крови и соответствующее количество бидистиллированной воды, добавляли 12 мл петролейного эфира. Пробы интенсивно встряхивали в течение 30 с, и после расслоения фаз петролейный эфир (верхний слой) отсасывали. Оставшуюся водную фазу разбавляли водой до конечного объема 7,5 мл. Затем к пробам добавляли 15 мл метиленхлорида и перемешивали, переворачивая пробирки 20 раз, избегая сильного встряхивания. Образовавшуюся при этом эмульсию разделяли центрифугированием в течение 20 мин при 4000 об/мин на центрифуге ЦЛР-1. После расслоения фаз 12 мл метиленхлоридного экстракта (нижний слой) отбирали шприцем с длинной иглой и переносили в чистую мерную пробирку. Экстракты промывали 1 мл 0,1н NaOH и встряхивали пробы в течение 15 с. Водную фазу сразу после расслоения отсасывали и доводили объем экстракта до 10 мл. Промытый экстракт можно хранить при 4 0С в течение 24ч.
Флюорогенный реактив готовят непосредственно перед использованием осторожным, но тщательным смешиванием концентрированной серной кислоты и этанола (8:2,5) при постоянном охлаждении.
К 10 мл экстракта (приготовленного как указано выше) приливали 10,5 мл флюорогенного реактива. Смесь интенсивно встряхивали в течение 15 с. После расслаивания верхний слой (метилхлорид) и остатки растворителя на стенках пробирки тщательно отсасывали. Пробы перемещали в темное место и через 1,5 ч измеряли интенсивность флюоресценции на флюориметре Hitachi F-4010 (Япония) при длине волны 530 нм. Для возбуждения свечением выделяли свет непрерывного спектра с длиной волны 470 нм.
Параллельно с опытными пробами осуществляли измерение флюоресценции раствора стандарта кортикостерона.
Содержание 11-ОКС в плазме крови определяли по формуле:
X= [(F0-Fk) P·100]/ (Fcт-Fk)V,
где Х - искомое содержание гормона, мкг/100 мл, Fo - флюоресценция опытной пробы в делениях шкалы прибора, Fст - флюоресценция стандарта, Fk - флюоресценция контрольной пробы, Р - количество стандарта стероида, мкг, V - объем плазмы, взятой для анализа, в мл.
2