РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
В процесі виконання даної роботи були використані різні тест-об'єкти і методи досліджень. Проте, як нам здається, немає підстав зв'язувати себе необхідністю наведення всіх цих матеріалів в даному розділі.
Це диктується різними обставинами і перш за все намаганням уникнути повторень, а там, де це необхідно, максимально наблизити методичні підходи до реалізації завдань, які ставляться.
Напевне, немає необхідності і в деталізації загальноприйнятих методів, досить ґрунтовно представлених в літературних джерелах, в зв'язку з цим ми обмежимося лише їх цитуванням.
В той же час, методи загального характеру, як наприклад, культивування калусних та суспензійних культур картоплі, склад поживних середовищ, оцінка рослин-регенерантів в культурі in vitro та in vivo будуть розглянуті нами в цьому розділі. Окремі ж методи будуть наводитись в ході викладу експериментального матеріалу. Це стосується головним чином методів виділення, очистки та дослідження метаболітів патогена.
2.1. Характеристика вихідного матеріалу
Об'єктами досліджень були 7 сортів картоплі селекції Інституту картоплярства УААН;
Стійкі:
1. Кобза - ранній сорт, столового призначення. Стійкий проти раку, стеблової нематоди, відносно стійкий проти фітофторозу, парші звичайної, вірусних та бактеріальних хвороб.
2. Луговська - середньостиглий сорт столового призначення. Характеризується високою польовою стійкістю проти фітофторозу, вірусних, бактеріальних хвороб, стеблової нематоди та раку.
3. Обрій - середньоранній сорт, універсального призначення. Стійкий проти раку, картопляної нематоди, відносно стійкий проти фітофторозу, парші звичайної, бактеріальних хвороб.
4. Слов'янка - середньостиглий сорт, столового призначення. Характеризується відносною польовою стійкістю проти фітофторозу, цистоутворюючої нематоди, парші звичайної, вірусних хвороб, звичайного біотипу раку.
Сприйнятливі:
5. Зов - ранній сорт, столового призначення. Стійкий проти раку. Відносно стійкий проти бактеріальних і вірусних хвороб, стеблової нематоди. Сприйнятливий до фітофторозу.
6. Незабудка - ранній сорт, столового призначення. Стійкий проти раку, відносно стійкий проти вірусних хвороб. Сприйнятливий до фітофторозу.
7. Повінь - ранній сорт, столового призначення. Стійкий проти звичайного біотипу раку, картопляної нематоди, альтернаріозу, сухої фузаріозної гнилизни. Сприйнятливий до фітофторозу.
В дослідженнях використовували раси Phytophthora infestans R 1-11 xyz (1.2.3.4.5.6.6.+ 0.7.8.10.11.) та R 1.2.3.4, які люб'язно надані нам Всеросійським Інститутом фітопатології та місцеву популяцію гриба, виділену в 1997 році з селекційних посадок картоплі Інституту картоплярства (уражене листя), а також фітотоксичні метаболіти P. іnfestans, виділені з культуральних фільтратів.
2.2. Методи культивування збудника фітофторозу картоплі
Культивування збудника проводили в чашках Петрі та пробірках (220 х 20 мл) на скошеному агаризованому вівсяно-цукрозному середовищі [190]. Умови вирощування стаціонарні, вологість 80-90%, температура 20±2? С. Пересів культури проводили через 22-24 доби в стерильних умовах. З метою одержання препаративної кількості фітотоксичних метаболітів культуру гриба P. infestans вирощували на рідких синтетичних середовищах Чапека [191] та Henniger [192] в матрасах, що містили 150 мл середовища. Густина засіву - 1 косяк на матрас. Культивування здійснювали при температурі 20±2?С протягом 18 діб. Виділення фітотоксичних метаболітів проводили згідно схеми, наведеної в розділі 4.1.
2.3. Культура калусних тканин та суспензійних клітин картоплі
Стерилізація вихідного матеріалу та умови культивування. В усіх дослідах використовували рослини in vitro, оздоровлені від вірусних та бактеріальних хвороб методом культури меристеми в поєднанні з хіміо- і термотерапією [193].
Роботи для одержання первинного калусу, суспензії клітин, посів культур грибів проводили в асептичних умовах - ламінар-боксах Flow HF- 48.
Стерилізацію поверхні боксу і рук проводили за допомогою 70%-го спирту та ультрафіолетового опромінення. Поживні середовища стерилізували в автоклаві при 0,7-0,8 атм надмірного тиску пари (температура в камері - 115? С) в наступному режимі: пропарювання текучим паром - 15 хвилин + стерилізація - 15 хвилин. Посуд стерилізували сухим паром у сушильній шафі при температурі 140?-150? С протягом 2-3 годин. Інструменти, дистильовану воду, ватні корки, марлю, папір стерилізували під тиском 2 атм (121? С) протягом 50-60 хвилин. Перед роботою у боксі скальпелі, пінцети, голки стерилізували повторно помістивши їх у склянку з 70-90% етиловим спиртом і обпалювали в полум'ї спиртівки.
Рослини вихідних сортів вирощували в пробірках (220 х 20 мл) на 15-20 мл модифікованого середовища Мурасіге і Скуга [194].
Культивували рослини в світловій кімнаті при температурі 25±1?С, освітленості 5000 лк, 16-ти годинному фотоперіоді та відносній вологості повітря 80-90%.
Розмноження рослин проводили загальноприйнятим методом живцювання in vitro [195].
Експланти. Культуру калусної тканини отримували, використовуючи стебла та листки пробіркових рослин вихідних сортів.
Експланти культивували в колбах об'ємом 250 мл або в чашках Петрі (60х11мм) на середовищі для одержання крихкого калусу (Табл.2.1). Культивування проводили в термостатах при температурі 25±1?С, відносній вологості повітря 80-90%.
Розмноження калусної тканини проводили шляхом безперервних пасажів (з інтервалом 3 тижні) на модифікованому середовищі М-С.
Утворений з вихідного експланту калус з метою одержання рослин-регенерантів переносили на свіже поживне середовище для морфогенезу. Культивували в світловій кліматичній камері при температурі 25±1?С, освітленості 5000±500