РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
2.1. Матеріали
Індивідуальні тРНКSer(GCU), тРНКSer(GGA) і тРНКLeu із T.thermophilus, а також сумарна тРНК із T.thermophilus виділені та люб'язно надані І.А.Крикливим (ІМБіГ НАН України).
Серил-тРНК синтетаза (90% чистоти) і лейцил-тРНК синтетаза ( ~90% чистоти) із T.thermophilus виділені і люб'язно надані к.б.н. Г.Д. Яремчук (ІМБіГ НАН України).
Лужна фосфатаза Escherichia coli (КФ 3.1.3.1) , фосфодіестераза отрути змії ("Sigma", США); полінуклеотидкіназа (КФ 2.7.1.78), виділена з E.coli, інфікованої фагом Т4 ("BioLab", США); тРНК-нуклеотидилтрансфераза (КФ 2.7.2.1) дріжджів люб'язно надана к.б.н. З.М.Петрушенко (ІМБіГ НАН України); РНК-лігаза ("Pharmacia", Швеція).
Т1-РНКаза (КФ 3.1.27.3) із Aspergilus orizae ("Sankyo", Японія), нуклеаза PhyM із Physarum polycephalum ("Pharmacia", Швеція), нуклеаза Р1 із Pencillium citrinum ("ICN", США).
? [32P] ATP, ? [32P] ATP з пит. акт. 2000-3000 Кі/ммоль, [32P] - цитидиндифосфат ([32P] рСр) з пит. акт. 300 Кі/ммоль ("Amеrsham", Велика Британія ).
Диметилсульфат, гідразин, дитіотреітол ("Fluka", Швейцарія); діетилпірокарбонат ("Calbiochem", США); боргідрид натрію ("Serva", Німеччина); ?-меркаптоетанол ("Merk", Німеччина); акриламід, N,N'-метиленбісакриламід, трис ("Fisher", США). Етилнітрозосечовина синтезована к. х. н. А.Г.Терент'євим (ІМБіГ НАН України).
Всі інші використані реактиви мали кваліфікацію "осч". Для приготування розчинів використовували деіонізовану воду.
2.2. Методи
2.2.1. Мічення тРНК. Реакцію мічення 3?-кінця молекул тРНК [32P]рСр проводили у 20 мкл 50 мМ трис-HCl рН 7,5, який містив 20мМ MgCl2; 10 мМ ?-меркаптоетанол; 10% диметилсульфоксид; 10мкг/мл альбуміну із сироватки бика; 1 мкМ АТР; 1,2 мкМ індивідуальну тРНК; 2,3 мкМ [5?-32P]рСр і 2,5 од. акт. РНК-лігази [24]. Реакцію здійснювали при 5?С протягом 12-15 годин, потім реакційну суміш наносили на 8% ПААГ і проводили очищення міченої тРНК електрофорезом.
Для мічення 3?-кінця молекул тРНК ?[32P]АТР проводили попереднє часткове відщеплення 3?-кінця фосфодіестеразою отрути змії. Реакцію проводили у 50 мкл 50мМ трис-HCl рН 8,3, який містив 10 мМ MgCl2; 4,8 мкМ індивідуальну тРНК і 0,02 од. акт. фосфодіестерази, протягом 15 хв при 18-25 ?С. Від фермента звільнялись шляхом фенольної екстракції, розчин тРНК підкислювали ацетатом натрію до кінцевої концентрації 0,3 М і осаджували тРНК етанолом. Відновлення ССА-кінця тРНК проводили як у роботі [144] у 20 мкл 50 мМ трис-HCl рН 8,3, який містив 10мМ MgCl2; 8мМ дитіотреітол; 40-50пМ ?[32P]АТР; 0,1мг/мл СТР; 1,2мкМ тРНК і 10 од. акт. тРНК-нуклеотидилтрансферази, протягом 45 хв при 37?С. Потім мічену тРНК відділяли електрофорезом у ПААГ.
Для мічення 5?-кінця молекули тРНК дефосфорилували за допомогою лужної фосфатази із Escherichia coli. Реакцію проводили у 50 мкл трис-HCl рН 8,0, що містив 0,1% додецилсульфат натрію; 3,6 мкМ індивідуальну тРНК та 1 од. акт. лужної фосфатази, протягом 30 хв при 60?С, потім додавали ще 1 од. акт. лужної фосфатази і продовжували інкубацію протягом 30 хв. Від ферменту звільнялись шляхом фенольної екстракції тРНК, яку потім осаджували етанолом. Мічення дефосфорилованої тРНК здійснювали у 20мкл 60 мкМ трис-HCl рН 8,0, який містив 9 мМ MgCl2; 4 мМ дитіотреітол; 40-50 пМ ?[32P]АТР; 1,2 мкМ тРНК та 10 одю акт. полінуклеотидкінази фага Т4, протягом 30 хв при 37 ?С [131].
2.2.2. Очищення та елюція із гелю мічених тРНК. Після мічення препарат тРНК наносили на 8% ПААГ, який містив 8 М сечовину. Електрофорез здійснювали у 50 мМ трис-боратному буфері рН 8,3, який містив 1 мМ EDTA, при 1500 В протягом 2-3 годин. У відповідності з радіоавтографом вирізали смужку гелю, яка містила мічену тРНК, і проводили елюцію міченої тРНК у 100 мкл 0,5 М амоній-ацетатного буфера рН 6,0, який містив 1 мМ EDTA і 0,1% додецилсульфат натрію, протягом 40-60 хв при температурі 20-25 °С. Далі мічену тРНК осаджували додаванням 300 мкл етанолу. Процедуру повторювали двічі. Осад збирали центрифугуванням, висушували і розчиняли у воді.
2.2.3. Гідроліз тРНК Т1-РНКазою та РНКазою Phy M. Частковий гідроліз тРНК Т1-РНКазою або РНКазою Phy M здійснювали, як у роботі [36]. Реакцію проводили у 150 мкл 20 мМ цитрату натрію рН 5,0, який містив 1мМ ЕДТА; 7 М сечовину; мічену тРНК; 5мкг сумарної тРНК і 0,1 од. акт. відповідної РНКази, протягом 15 хв при 55?С.
2.2.4. Визначення нуклеотидної послідовності тРНКSer і тРНКLeu. Нуклеотидну послідовність тРНК визначали методом швидкого гель-секвенування на основі специфічної хімічної деградації полінуклеотидного ланцюга, розробленого Д.Пітті [93]. Обраний метод дозволяє визначити нуклеотидну послідовність тРНК протягом лише декількох днів і потребує невеликої кількості препарату. Істотним недоліком методу є неможливість визначити хімічну природу та розташування мінорних нуклеотидних залишків, що потребує окремих досліджень з використанням інших методів.
Специфічна хімічна модифікація залишків гуанозину. 2 мкл 3'-міченої тРНК і 2мкл сумарної тРНК (5мг/мл) додавали до 150 мкл 50мМ какодилату натрію рН 5,5, який містив 1мМ EDTA, змішували та охолоджували до 0°С. Потім додавали 0,3 мкл диметилсульфату і проводили інкубацію при 90°С протягом 50с. Реакцію зупиняли додаванням 38 мкл охолодженого до 0°С 1М трис-ацетатного буфера рН 7,5, який містив 1М ?-меркаптоетанол і 1,5М ацетат натрію. Суміш швидко охолоджували до 0°С і тРНК осаджували додаванням 600 мкл холодного етанолу. Осад збирали центрифугуванням, висушували, розчиняли у 100 мкл 0,3М ацетату натрію рН 4,5 і знову осаджували додаванням 450 мкл етанолу. Осад центифугували, висушували і розчиняли у 10 мкл 1М трис-HCl буфера рН 8,2, додавали 10 мкл щойнорозчиненого 0,4 М боргідриду натрію і проводили інкубацію у темряві при 0°С протягом 30 хв. Реакцію зупиняли додаванням 200 мкл 1,5 М ацетату натрію рН 4,5 і 750 мкл етанолу. Осад збирали центрифугуванням і двічі переосад