РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи дослідження
Для дослідження змін кальцієвої сигналізації та реєстрації процесу секреції в
свіжоізольованих хромафінних клітинах щура при дії факторів, що стимулюють
секрецію використовувались наступні методичні підходи:
* Виділення гостроізольованих хромафінних клітин щура;
* Реєстрація кальцієвих транзієнтів за допомогою флуоресцентного методу з
використанням кальцій-чутливого барвника fura-2 АМ;
* Реєстрація за допомогою електрохімічного методу процесу секреції шляхом
використання електроду з карбоновим волокном;
* Ідентифікація за допомогою цитохімічного методу норадреналін та адреналін-
секретуючих клітин мозкової речовини наднирника щура.
* Статистична обробка отриманих результатів проводилась за допомогою
стандартних методів аналізу.
Моделювання процесу секреції здійснювалось за допомогою аплікації у
зовнішньоклітинний розчин деполяризуючого агента (50мМ KCl) або агоністів
ацетилхолінових рецепторів (АХ, мускарину та нікотину). Дослідження вкладу
різних типів АХ рецепторів в формуванні кальцієвого транзієнту при стимуляції
клітини розчином АХ застосовувались блокатори відповідних типів АХ-рецепторів
тубокурарин та атропін. Дослідження ролі внутрішньоклітинних депо в цьому
процесі проводилось з використанням СССР, кофеїну та тапсігаргіну.
2.1. Об`єкт дослідження. Загальна характеристика хромафінних клітин наднирника
По своєму походженню секреторні клітини мозкової речовини наднирників
аналогічні постгангліонарним нейронам симпатичної нервової системи; не дивно
тому, що і функціонують вони аналогічно. Вегетативна (автономна) нервова
система включає в себе парасимпатичну систему з холінергетичнми пре- і
постганглінарними нервами, симпатичну нервову систему з холінергічними
прегангліонарними і адренергічними постгангліонарними нервами і мозковий шар
наднирників. Останній, по суті справи, є продовженням симпатичної нервової
системи, оскільки прегангліонарні волокна черевного нерву закінчуються на
хромафінних клітинах мозкового шару наднирників, продукуючих катехоламіни
–норадреналін, адреналін. Значить, мозковий шар наднирників представляє собою
спеціалізований ганглій без продовження у вигляді аксонів. Хромафінні клітини
цього шару синтезують, запасають і секретують продукти, дія яких здійснюється
на віддалі від місця їх синтезу. Таким чином, мозковий шар здійснює функцію і
ендокринного органу – чудовий приклад взаємодії нервової і ендокринної системи
[192].
Гормони симпатоадреналової системи є життєво необхідними, їх роль в організмі
надзвичайно велика: саме вони забезпечують адаптацію до гострих і хронічних
стресів. Адреналін і норадреналін – основні елементи реакції “боротьби і
втечі”. Відповідь на викликаний при цьому переляк включає в себе швидку
інтегровану перебудову багатьох складних процесів в органах, що безпосередньо
приймають участь в даній реакції (мозок, м’язи, серцево-легенева система і
печінка) [193].
Катехоламіни самі по собі не стимулюють реакції “боротьби і втечі”, але
включаються у відповідь разом з глюкокортикоїдами, вазопресином, ангіотензином,
глюкогоном і соматоторопіном. Катехоламінові гормони представляють собою 3-,4-
дигідроксипохідні фенилетиламіну. Вони синтезуються в хромафінних клітинах
мозкового шару наднирників. Свою назву ці клітини отримали тому, що містять
гранули, що забарвлюються під дією біхромату калію в червоно-рудий колір.
Головний продукт мозкового шару наднирників – адреналін. На долю цієї сполуки
припадає близько 80% усіх катехоламінів мозкового шару. Поза мозкової речовини
адреналін не утворюється.
В мозковому шарі наднирників містяться хромафінні гранули – органели, що здатні
до біосинтезу, поглинання, запасання і секреції катехоламінів. Окрім останніх,
в склад цих гранул входять ряд інших речовин, в тому числі АТФ-Мg2+, ДБГ,Ca2+ і
білок хромогранін А. Катехолміни потрапляють в гранули з допомогою АТФ –
залежного механізму транспорту і зв`язуються з нуклеотидом в співвідношенні 4/1
. Норадреналін запасається в цих гранулах, але може виходити з них і
метилуватися; утворений в результаті адреналін включається в нову популяцію
гранул [193].
Катехоламіни і АТФ вивільнюються в тому ж співвідношенні, в якому вони існують
в гранулах. Це відноситься і до інших компонент, включаючи ДБГ, кальцій і
хромогранін А. Гормони, які зв`язуються з b1- b2- рецепторами, активують
аденилатциклазу, тоді як гормони, асоційовані з a2-рецепторами, інгібують її.
Зв`язування катехоламінів індукує конденсування рецепторів з G-білком, який
потім зв`зується з ГТФ. Це або стимулює (Gs), або інгібує (GJ) аденилатциклазу,
що в результаті призводить до підсилення чи подавлення синтезу сАМР. Реакція
виключається, коли ГТФ-аза, зв`язана з a-субодиницьою G-білка, гідролізує ГТФ.
a1-рецептори беруть участь в процесах, які призводять до зміни
внутрішньоклітинної концентрації кальцію чи до зміни метаболізму
фосфатиділінозітиду. Не виключено, що для цієї реакції необхідний особливий
G-білковий комплекс [194].
Нервова стимуляція мозкового шару наднирників приводить до злиття хромафінних
гранул з плазматичною мембраною і таким чином обумовлює вивільнення
норадреналіну і адреналіну шляхом екзоцитозу. Цей процес залежить від кальцію,
і подібно іншим процесам екзоцитозу стимулюється холінергічними і
b-адренергічними агентами і інгібується a-адренергічними агентами [195].
2.2. Виділення окремих хромафінних клітин
Експерименти, описані в даній роботі, проводились на свіжоізольованих
хромафінних клітинах наднирників статевозрілих щурів. Нами використовувались
дорослі (5ё6 місяців) самки білих щ
- Київ+380960830922