РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ, МОДЕЛІ, МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ.
КЛІНІЧНА ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСТЕЖЕНИХ ХВОРИХ
2.1. Матеріал, моделі та методи дослідження
Експериментальні дослідження проведені на 57 щурах-самцях популяції Вістар. Під
час дослідів тварини перебували на стандартному раціоні віварію. Розподіл
тварин по серіях експериментів наведений в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1
Розподіл щурів по групам дослідів
Досліди
Кількість щурів
На моделі монойодацетатного остеоартрозу щурів: оцінка протизапальної
активності амізону в порівнянні з індометацином та німесулідом; вивчення впливу
препаратів на морфологічні та біохімічні характеристики суглобового хряща;
нирки та слизову оболонку шлунково-кишкового тракту.
42
У здорових щурів: дослідження фармакокінетичної взаємодії амізону
(амідопіриновий тест)
15
Всього
57
Модель монойодацетатного остеоартрозу. Експериментальний остеоартроз
відтворювався на 32 білих щурах-самцях породи Вістар вагою 220 -300 г (в
середньому 250±7,2 г), віком 10-12 місяців, як описано С.Guingamp та співавт.
[157]. В колінні суглоби під легким ефірним наркозом через інфрапателярну
зв’язку було введено 3 мг монойодоцтової кіслоти, розчиненої в 50 мкл
стерильного фізіологічного розчину.
Введення амізону, індометацину та німесуліду починали на 20 день експерименту,
після формування дегенеративно-дистрофічних змін в суглобах, ініційованих
введенням монойодацетату. Трьом групам тварин протягом 10 днів інтрагастрально
вводили амізон в дозі 50 мг/кг, німесулід – 10 мг/кг та індометацин - 3 мг/кг
на 1% розчині крохмалю (табл. 2.2). Обрані дози в літературі розглядаються як
терапевтичні і не спричиняють загибелі тварин [9, 187, 273]. Четверта група
щурів з індукованим ОА лікування не отримувала. Контрольну групу склали 10
інтактних щурів. Під час експерименту тварини знаходились на стандартному
раціоні віварію. З досліду тварин виводили шляхом декапітації під легким
ефірним наркозом на 30-й день експерименту.
Таблиця 2.2
Розподіл тварин по групах
Групи тварин
Дози
Тривалість введення, дні
Кількість тварин
Контроль (інтактні тварини)
10
Монойодацетатний остеоартроз
Нелікований ОА
Індометацин
3 мг/кг
10
Амізон
50 мг/кг
10
Німесулід
10 мг/кг
10
Всього
10
32
Розвиток експериментального остеоартрозу та ефективність лікування контролювали
динамікою рухливості ураженого колінного суглобу.
Рухливість колінного суглобу оцінювалась шляхом вимірювання його кута
розгинання за допомогою транспортиру до початку експерименту та на 3, 20 (до
лікування) та 30 дні (10 день лікування) після введення монойодоцтової кислоти
в суглоб.
Дослідження стану колінних суглобів щурів. Колінні суглоби отримували після
декапітації щурів на 30 день експерименту. Стан суглобового хряща оцінювали
макроскопічно, гістологічно та біохімічно.
Макроскопічний аналіз проводили після розтину колінного суглобу та виділення
суглобових поверхонь. Ступінь ураження оцінювали візуально від 0 до 4 балів: 0
- незмінені суглобові поверхні; 1 - слабке пожовтіння суглобового хряща, 2 -
невелике ерозування хряща в ділянках навантаження, 3 - велике ерозування хряща
з поширенням до субхондральної кістки; 4 - поширене ерозування хряща з
оголенням субхондральної кістки [157]; при наявності ексудативного синовіту
додавали 1 бал.
Морфологічне дослідження суглобів щурів проводили загальновизнаними методами,
після фіксації матеріалу в формаліні та забарвленні гематоксилін-еозином, по
ван Гізон та толуідиновим синім [57]. При морфометричному аналізі визначали
товщину хряща та його цитогенність (щільність розташування хондроцитів на
умовній одиниці площі). Гістологічний стан суглобових тканин додатково
оцінювали в балах згідно методичним рекомендаціям [61].
Біохімічні дослідження. Після виділення суглобових поверхонь знімали шар
суглобового хрящу до субхондральної кістки, промивали холодним фізіологічним
розчином для видалення крові, 2 рази обробляли сумішшю етанол/ефір (1:1) та
гомогенізували в фарфоровій ступці.
Для визначення кількості загальних глікозаміногліканів (ГАГ) по вмісту в них
гексуронових кислот [61] 30 мг подрібненої хрящової тканини заливали 4 мл 0,5Н
розчину соляної кислоти та гідролізували на водяній бані при температурі 100оС
протягом 15 хвилин. Потім пробірки охолоджували під проточною водою,
центрифугували 10 хвилин 3000 об/хв. До 0,2 мл надосаду додавали 1 мл
охолодженого розчину тетраборату натрія (9,5 г/л) на концентрованій сірчаній
кислоті (Саваль), витримували 10 хвилин на водяній бані при температурі 100оС.
Після охолодження під проточною водою в дослідні проби додавали 0,04 мл розчину
карбазолу на абсолютному етанолі (1,3 г/л), а в контрольні проби – 0,04 мл
абсолютного етанолу та нагрівали 15 хвилин на водяній бані при температурі
100оС. Після охолодження проби фотометрували при 540 нм відносно контролю на
реактиви. Кількість гексуронових кислот розраховували за калібрувальним
графіком в мг/г хрящової тканини.
В сироватці крові визначали вміст сульфатованих глікозаміногліканів та їх
фракцій (І фракція – хондроїтин-6-сульфат, ІІ фракція – хондроїтин-4-сульфат,
ІІІ фракція – кератан-, гепарансульфати та гепарін) за реакцією з резохіном
[61] та рівень серомукоїду [28].
Для порівняння безпеки фармакотерапії амізоном, німесулідом та індометацином
проводили візуальну оцінку стану слизової шлунково-кишкового тракту та
біохімічний аналіз сироватки крові, гомогенатів нирок та слизової шлунку щурів
з експериментальним остеоартрозом.
За візуальною оцінкою дефекти слизової шлунку та 12-палої кишки діаметром 1-2
мм відносили до виразок першого ступеня важкості, 2-3 мм - до другого, а бі
- Київ+380960830922