РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень
Робота грунтується на результатах комплексного обстеження 107 хворих з отруєнням БП віком від 15 до 78 років, які знаходилися на стаціонарному лікуванні у відділеннях анестезіології та інтенсивної терапії та гастроентерологічних відділеннях Тернопільської (64 хворих) та Рівненської (43 хворих) обласних клінічних лікарень у 1991-2001 роках.
При виконанні експериментальних досліджень використано екстракт БП, кров 26 донорів і 190 білих щурів.
У відповідності з поставленими задачами проведено такі дослідження:
а) вивчення впливу Пен на виживання щурів, біоенергетику, активність ферментів цитолізу і холестазу крові щурів, отруєних ЕБП;
б) вивчення динаміки показників обміну аденіннуклеотидів, гліколізу і морфології клітин крові донорів, інкубованої з ЕБП, ЕБП і Пен;
в) вивчення показників обміну аденіннуклеотидів і будови еритроцитів у крові хворих з отруєнням БП;
г) вивчення впливу пеніциліну на клінічний перебіг отруєння БП, показники обміну аденіннуклеотидів і форму еритроцитів у крові хворих.
Проведено 10 серій експериментальних досліджень: серія 1 - летальність, тривалість життя щурів, активність ферментів цитолізу і холестазу крові щурів, отруєних ЕБП і лікованих Пен; cерії 2, 3, 4 - контроль, реакція крові донорів протягом строку інкубації; cерії 5, 6 - реакція крові донорів на додавання ЕБП; cерії 7, 8 - реакція крові донорів на додавання Пен; cерії 9, 10 - реакція крові донорів, інкубованої сумісно з ЕБП і Пен.
Дослідження у хворих проводили в період розпалу отруєння і в період ранньої реконвалесценції.
2.2. Методи досліджень
В роботі використовували загальноприйняті клінічні методи дослідження, а також лабораторно-інструментальні дані: загальний аналіз крові; біохімічний аналіз крові з визначенням рівня білірубіну за методом Єндрашика, активності АлАТ, АсАТ за Reitman&Popper, загального білка з допомогою біуретової реакції, сечовини за уніфікованим методом по кольоровій реакції з діацетилмонооксимом, креатиніну за уніфікованим методом по кольоровій реакції Яффе (метод Поппера), протромбіну за методом Сульє-Ларьє, фібриногену за уніфікованим гравіметричним методом з використанням тромбіну; загальний аналіз сечі. Стан печінки вивчали, використовуючи ультразвуковий сканер типу SAI-35A (Японія) згідно загальноприйнятої методики.
Бліду поганку збирали в листяно-хвойних лісах Тернопільської області. В день збору гриби очищали від домішок, промивали водою і гомогенізували. Екстракт блідої поганки (ЕБП) отримували за методом [212]. До гомогенату додавали метанол у співвідношенні 1:10 (гриби:спирт), кип'ятили 30 хв, фільтрували з використанням водоструминної помпи, і випаровували до об'єму, 1 мл якого містив 25 мг сухої БП.
У токсикологiчних дослiдженнях використано 54 щурі-самцi з середньою масою 195 г. ЕБП вводили тваринам внутрiшньоочеревинно. Про ступiнь токсичностi судили за дозою екстракту, виживання протягом 7 днів i тривалостi життя щурiв, якi загинули. У дослiдах при встановленнi гострої токсичностi ЕБП тварини були роздiленi на 5 груп по 6 щурiв у кожнiй. На тваринах кожної групи дослiджувалась одна доза грибного екстракту вiд найменшої (20 мг/кг), яка не спричиняла загибелi тварин, до 40 мг/кг, пiсля введення якої гинули всi отруєнi щурi. Iз 30 тварин, отруєних ЕБП, до 24 год вiд початку дослiду загинуло сiм щурiв (40 %), протягом перших 2-х дiб - 11 (37 %), на 3-ю добу - одна тварина. Середня тривалiсть життя тварин, яким вводили ЕБП, коливалась вiд 5-ти год (пiсля введення 40 мг/кг екстракту) до 17 год (пiсля введення 25 мг/кг).
Обробка результатiв визначення гострої токсичностi ЕБП методом Кербера і з використанням мiлiметрової сiтки методом Лiтчфiльда i Уiлкоксона дала однаковi результати: ЛД50 - 32,5, ЛД84 - 38,4 і ЛД16 - 20,6 мг/кг [220]. Контрольні показники визначали у крові інтактних тварин. Отруєння щурів проводили внутрішньоочеревинним введенням ЕБП у сублетальній дозі (20 мг/кг) і ЛД50. Лікування розпочинали через 3 год після отруєння. Пен, ампіцилін, оксацилін і ампіокс вводили внутрішньом'язово через 12 год протягом 3-х діб.
Для вивчення реакцій крові людини на додавання ЕБП і Пен використовували кров донорів із ІІ-ІІІ групами крові за системою АВО; кров брали ранком натще з ліктьової вени; як антикоагулянт використовували гепарин у концентрації 10-12 МО/мл [213-216]. Інкубацію проводили при 37 °С протягом 60 і 180 хв при постійному перемішуванні. Контрольні показники визначали у крові донорів до інкубації, через 60 і 180 хв інкубації при 37 °С, додаючи до неї ізотонічний розчин хлориду натрія у кількості, відповідній об'єму робочого розчину ЕБП. Добавки ЕБП до крові людей вносили, враховуючи дані літератури, що для людини масою 70 кг смертельна доза отрути міститься в 50 г свіжих грибів [109, 161, 217, 218]. ЛД50 для людини складає 25 г свіжих грибів (2,5 г сухих). Об'єм циркулюючої крові у людини становить 7 % маси тіла, що для людини масою 70 кг дорівнює 5 л. За умови повного одномоментного потрапляння отрути у кров людини, в ній може утворитися концентрація 500 мг/л ЕБП, що складає 0,5 мг/мл. Робочий розчин ЕБП готували, випаровуючи 1 мл ЕБП, сухий осад розводили у 10 мл ізотонічного розчину хлориду натрія, після чого 0,2 мл розчину додавали до 1 мл донорської крові. Відсутність метанолу у робочому розчині ЕБП визначали хроматографічним методом. Пен у кров вносили в дозі 1 млн ОД/л. Інкубацію проводили при 37 °С протягом 60 і 180 хв.
Вмiст аденозинтрифосфорної (АТФ), аденозиндифосфорної (АДФ) i аденозинмонофосфорної (АМФ) кислот у кровi донорiв і хворих з отруєнням БП визначали з використанням набору реактивiв фiрми "Boeringer Mannheim" (ФРН) на СФ-46. Визначення концентрації АТФ в крові проводили ферментативним методом за Bucher Th. [234], згідно якого в результаті взаємодії АТФ і 3-фосфогліцеринової кислоти при участі фермента фосфогліцераткінази утворюються АДФ і 1,3-дифосфогліцер