РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материал исследования
Работа выполнена на 305 нелинейных крысах-самках (массой 200?15г, разводка вивария института нейрохирургии АМН Украины).
Материалом экспериментальных исследований служила ткань головного и спинного мозга и селезенка (нелинейные крысы-самки, вес 200?15г).
Исследования проводили в 3 этапа.
1-й этап - разработка модели ЭАЭ у крыс (n=90) .
2-й этап - исследование функциональной активности фагоцитирующих клеток селезенки и головного мозга на этапах развития ЭАЭ (5-е, 12-е, 20-е, 35-е и 70-е сутки после индукции энцефаломиелита) (n=81).
3-й этап - исследование возможности коррекции ЭАЭ клетками аллогенного головного мозга новорожденных животных: цельной фракцией и фракциями обогащенными нейронами или глией (n=134).
На 3-м этапе в зависимости от заданных условий эксперимента животные были подразделены на следующие группы:
-1 группе животных (n=30) вводили цельную суспензию клеток незрелого мозга;
- 2 группе (n=30) вводили нейрональнообогащенную клеточную фракцию;
- 3 группе (n=30) вводили глиальнообогащенную клеточную фракцию;
- 4 группу (n=30) составили животные без лечения (индукция ЭАЭ), которым вводили питательную среду;
- 5 группу, контроль, (n=14) составили интактные животные.
Во время эксперимента всех животных содержали в одинаковых условиях. Животных наблюдали ежедневно в течение 3-х месяцев.
Коррекцию проводили на 12-е, 14-е и 16-е сутки после индукции энцефаломиелита введением в брюшную полость клеток аллогенного головного мозга новорожденных животных в количестве 5-8 млн. клеток мозга (на 1 животное). Исследования проводили на 20-е, 40-е и 70-е сутки после индукции ЭАЭ.
2.2. Методы исследования
Моделирование ЭАЭ у крыс.
В основу методики воспроизведения ЭАЭ у крыс взяты рекомендации Давыдовой Г.С. (1969). Животных наркотизировали (тиопентал натрия), ткань спинного мозга удаляли и помещали в буферный раствор, не содержащий ионов кальция и магния (CМF- буфер), освобождали от оболочек. После механической дезагрегации кусочки мозга (объем фрагментов не превышал 1 мм2) растирали в фарфоровой ступке до получения однородной массы. Гомогенат мозговой ткани в конечной концентрации (250 мг/мл и/или 500мг/мл) и полный адъювант Фрейнда в соотношении 1:1 смешивали в ступке и вводили в подушечки лап крысам весом 200 ? 15г по 0,1мл в каждую лапу.
Получение суспензии нервных клеток развивающегося головного мозга.
Клеточную суспензию получали из мозга 1-дневных крыс по методу [4]. Новорожденных крыс забивали цервикальной транссекцией. Ткань мозга извлекали и переносили в раствор буфера не содержащего ионов кальция и магния (CMF буфер), тщательно очищали от оболочек, промывали, затем буфер заменяли питательной средой и производили диссоциацию ткани многократным пипетированием. Разделение на нейрональную и глиальную фракции проводили по методу [111]. Суспензию диссоциированных клеток наслаивали на дно пластиковых чашек Петри диаметром 5см и инкубировали 15-30 мин при 37оС в атмосфере, содержащей 5% СО2 . По истечении времени инкубации суспензию не прикрепившихся к пластику клеток переносили в пробирки (клеточная популяция обогащенная нейронами), а в чашку Петри добавляли новую порцию среды и тщательно отслаивали пипетированием от пластика клеточную популяцию, обогащенную глией. Полученные суспензии клеток использовали для дальнейшего введения животным.
Патоморфологическое исследование (световая микроскопия).
Животных наркотизировали (тиопентал натрия), вскрывали брюшную полость, забирали периферическую кровь и селезенку. Спинной мозг осторожно извлекали из полости позвоночного канала и выделяли поясничный отдел, поскольку именно в этом отделе наиболее часто развивается демиелинизирующий процесс при ЭАЭ. Ткань спинного мозга фиксировали в 10% нейтральном формалине в течении 24-48ч и заливали в целлоидин-парафин [12]. Далее из тканевых блоков спинного мозга крыс готовили срезы толщиной 5-6 ?м, которые окрашивали гематоксилин-эозином, (обзорные методики) и бриллиантовым крезиловым фиолетовым [46]. Для светооптического исследования материала использован цитоанализатор изображения "Ibas-2000", снабженный телемонитором с обеспечением фоторегистрации.
Электронно- микроскопическое исследование.
Для электронно-микроскопического исследования фрагменты ткани экспериментальных животных розмером 1х1мм3 фиксировались в смеси 4% параформальдегида, 2,5% глютаральдегида и 4% сахарозы на 0,1 молярном фосфатном буфере pH=7,4 с последующей дофиксацией в 1% растворе четырехокиси осмия [13], обезвоживались в возрастающих концентрациях этанола и оксипропилена и заливались в смесь эпоксидных смол (эпон-эралдит) по стандартным методикам электронной микроскопии. Ультратонкие срезы толщиной 600 А изготавливались на ультратомах ЛКБ и Рейхардт. Для улучшения контрастности окрашивались по Рейнтгольдсу (1963) и просматривались в электронном микроскопе ЕМ-400Т фирмы "Филипс".
Для прицельного ультратомирования и более глубокой оценки полученных данных из эпоксидных блоков изготавливались полутонкие срезы толщиной 1 000 А, окрашивались метиленовым синим - пиронином и просматривались в светооптическом микроскопе Axiophot фирмы "OPTON" (Германия).
Методика выделения микрогии и инфильтрирующих ЦНС лейкоцитов.
Микроглию и инфильтрирующие ЦНС лейкоциты (рис2.1), выделяли из ткани мозга крыс в ступенчатом градиенте перколла по методу Sedgwick J.и соавт. (1991). Животных наркотизировали (тиопентал натрия), ткань мозга извлекали и помещали в CМF буфер, освобождали от оболочек. После механической дезагрегации кусочки мозга (объем фрагментов не превышал 1 мм3) инкубировали 30 мин в 0,25 % растворе трипсина при 37оС в атмосфере содержащей 5% СО2. Полученную взвесь клеток отмывали от остатков трипсина CMF буфером, осадок ресуспендировали в перколле (удельная плотность 1.088). Полученную взвесь подслаивали под слой перколла с у