Активація систем зсідання крові та фібринолізу за розвитку солідних пухлин

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
2.1 Обгрунтування доцільності вибору моделі та методів дослідження.
Тромбози є одним з найпоширеніших ускладнень за злоякісного росту. Поглибленими обстеженнями хворих на рак виявлено, що понад 50% з них слабують на тромбоз вен, причому наявність тромбозу не завжди виявляє себе вираженими змінами системи гемостазу ?4?. Більше того, 15% хворих на злоякісні новоутворення слабують, також, на тромбоемболізм ?2?, який є другою за частотою причиною смерті онкохворих ?3?.
Як уже зазначалося вище, в огляді літератури, за злоякісної прогресії фіксують як активацію системи зсідання крові, що виражається зростанням рівнів фібринопептиду А ?9-13], фрагментів протромбіну 1+2 та комплексу тромбін-антитромбін ІІІ ?14-16?, так і фібринолітичної системи, що потвержується високими рівнями у плазмі крові хворих на рак продуктів деградації фібрину [18], комплексів плазмін-?2-антиплазмін [71], активаторів плазміногену та РАІ [74]. За таких умов накопичення продуктів деградації фібрину, які, як відомо, є інгібіторами латеральної асоціації протофібрил, рівновага системи гемостазу має зміщуватися у бік зниження інтенсивності згусткоутворення [91]. Зростання рівня тромбозів, тим паче тромбоемболії у хаорих на рак, виходячи з наявної інформації годі пояснити.
Основних причин нестикування результатів тестування системи гемостазу за злоякісного процесу та одержаних під час дослідження функціональної активності системи гемостазу у чистих системах є декілька. Насамперед, зосередження дослідження останнім часом компонентів системи гемостазу за злоякісного процесу in vivo виключно на клінічному матеріалі через відсутність продажних тест-наборів до білків плазми крові тварин. Внаслідок такого підходу результати досліджень системи гемостазу практично неможливо зіставити з фазами злоякісного процесу. Неможливість рандомізувати хворих першої групи призвела до великого розмаху значень, аж до взаємо-суперечливих результатів. Другим запереченням проти такого підходу є те, що за допомогою моноклональних антитіл можна визначити лише загальний рівень даного конкретного антигену у плазмі крові без урахування функціональної активності того чи того фактора систем зсідання крові та фібринолізу. Відтак зафіксоване продажними тест-наборами зростання чи зниження рівня, скажімо, t-PA у плазмі крові абсолютно не відбиває насправді рівня активації фібринолітичної системи.
Окрім того, у літературі зазвичай є абсолютно ігнорованою різниця між солідними, асцитними пухлинами та лейкозами. Як правило, коли переносять результати виміру секреторної активності злоякісних клітин одержаних у культурі, оперують даними визначеними за розвитку лейкозів. Ясна річ, наявність у крові великої кількості дисемінованих клітин, які активно секретують фактори коагуляції та фібринолізу здатна серйозно змінити баланс активності систем зсідання крові та фібринолізу. Навряд чи можна такі результати механічно переносити на розвиток солідних пухлин де сумарна маса секретуючих клітин іноді не сягає і тисячної частки сумарної маси гепатоцитів, а баланс системи гемостазу докорінно зміщується. Якщо додати до того, що секреторну активність клітин солідних пухлин зазвичай вимірюють за кількістю окремих факторів у тканині пухлини, навіть не співставляючи з рівнями цих факторів у плазмі стає зрозумілою недостатність наявних даних для аналізу стану системи гемостазу у злоякісній прогресії.
З огляду на сказане було взято як модель карциному Льюїс, проведено адаптацію до плазми крові мишей функціональних тестів окремих компонентів систем зсідання крові та фібринолізу та скринінгового турбідиметричного тесту. Використання турбідиметрії, заснованої на вимірювання світлорозсіювання новоутвореним згустком, дало змогу оперативно зіставляти баланс активності коагуляції та фібринолізу. Під час такого вимірювання, по ініціації утворення згустку у тестованій плазмі, спочатку швидкість утворення фібрину переважає швидкість його деградації, тож світлорозсіювання згустком наростає, потому, через переважання швидкості деградації, об'єм згустку меншає і світлорозсіювання падає. Таким чином, висхідна лінія кривої характеризує швидкість і час коагуляції, а низхідна - фібринолізу. Застосування такого методу дало змогу оцінити баланс активності двох систем підтримання гемостазу і визначити першопричину інтенсифікації процесу згусткоутворення за злоякісної прогресії. Використання функціональних тестів дало змогу конкретизувати внесок окремих факторів у зміни, фіксовані за злоякісної хвороби.
Отже, побудова дослідження системи гемостазу за розвитку карциноми Льюїс як фіксація балансу активності систем зсідання крові та фібринолізу скринінговим турбідиметричним тестом з подальшим доповненням його функціональними тестами окремих компонентів дало змогу одержати цілісну картину змін у системі гемостазу за злоякісної прогресії. Використання як моделі детально патологічно охарактеризованої карциноми Льюїс дало змогу зіставити зміни та направленість системи гемостазу з певними фазами метастатичного процесу.
Задля визначення першопричини порушень системи гемостазу за злоякісної прогресії фізіологічної ролі настінкових фібринових депозитів та дослідження їхньої можливої участі у гематогенному метастазуванні біохімічні дослідження системи гемостазу було доповнено виконанням ряду патофізіологічних досліджень. Оскільки настінкові фібринові плівки здатні модулювати білковий обмін між плазмою крові та прилеглими тканинами, насамперед було визначено проникність стінок кровоносних судин для білків плазми крові. З цією метою було одержано сумарну глобулінову фракцію плазми крові мишей, проведено її мічення радіоактивним йодом, визначено оптимальні терміни вимірювання. Було показано, що максимальне насичення радіоактивним йодом за таких умов у тканинах легень інтактних мишей настає через тридцять хвилин по введені препарату. Надалі в експериментах використовували саме цей термін. Використання максимально широкої за білковим складом фракції глоб