РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Морфофункціональний стан кровоносних судин, ланок гемомікроцирку- ляторного русла, кардіоміоцитів та міоендокринних клітин серця в нормі та в різні терміни після дії загальної глибокої гіпотермії ми проводили на 140 білих безпородних статевозрілих щурах-самцях, масою 160-180 г (табл. 2.1). У кожному експерименті враховується можливість екстраполяції на людину результатів досліджень, виконаних на лабораторних тваринах. Проводячи вибір піддослідних тварин, ми керувались даними про те, що білі щурі є більш вигідним об'єктом для групового експерименту; окрім того, відомо, що вдається знизити температуру їх тіла до 0°С з наступним відновленням нормальних функцій і життєздатності [142]. Крім того, за даними літературних джерел, будова різних відділів міокарда щура і людини подібна ?105, 122,136?.
Таблиця 2.1
Загальний розподіл тварин по групах і етапах проведення експериментів
Групи
тваринЕтапи
експериментуК-ть
тваринМетоди дослідженняін'єкцій-
нийгістологічнийелектронно-мікроско-
пічний
гемато-ксилін і еозинфуксе-лін-пік-рофук-син1Контроль2055552Відразу після дії холоду20555531, 3, 7, 14, 30-та доби постгіпо-термічного пе-ріоду10025252525Всього14035353535
Піддослідних тварин розділили на три групи. Перша - 20 тварин служили контролем. Другу групу становило теж 20 тварин, яких охолоджували, знижуючи ректальну температуру до +12 -+ 13°С і відразу забирали матеріал на дослідження. У третій групі на 100 тваринах вивчали морфофункціональний стан та відновно-адаптаційні процеси на 1-шу, 3-тю, 7-му, 14-ту та 30-ту доби після дії загальної глибокої гіпотермії (табл. 2.1). Матеріалом для дослідження служили шматочки міокарда різних відділів серця.
Тварин контрольної і піддослідних груп до і після експерименту утримували в нормальних умовах віварію на повноцінному харчуванні, без обмежень у питній воді. Щоб виключити вплив добового і сезонного ритмів біологічної активності, експеримент проводили у весняно-літній період, у ранковий час, перед годуванням.
Евтаназія щурів здійснювалася методом передозування ефіру для наркозу.
Вивчення кровоносних судин, ланок ГМЦР, кардіоміоцитів та міоендокринних клітин здійснювали комплексними морфофункціональними методами. Для вирішення поставлених завдань були проведені наступні дослідження:
1. Моделювання загальної глибокої гіпотермії у щурів в експерименті.
2. Ін'єкційний метод дослідження кровоносного русла міокарда різних відділів серця щурів у нормі та на етапах постгіпотермічного періоду.
3. Гістологічні дослідження стінки кровоносних судин, ланок ГМЦР і кардіоміоцитів серця в нормі та в різні терміни після дії загальної глибокої гіпотермії.
4. Електронномікроскопічне дослідження ГМЦР, кардіоміоцитів та міо-ендокринних клітин у нормі і після дії загальної глибокої гіпотермії.
5. Стереологічний аналіз різних типів секреторних гранул у міо-ендокринних клітинах передсердь і вушок із статистичною обробкою даних.
2.1. Моделювання загальної глибокої гіпотермії у щурів в експерименті
Тварин поміщали у невеликі клітки (одна клітка для однієї тварини), які не обмежували їх рухомості і не затруднювали дихання. Клітки знаходились у холодовій камері, де підтримувалась постійна температура -32°С. Ректальну температуру у тварин знижували з 38°С до +12-+13°С, що відповідає температурним межам загальної глибокої гіпотермії (+10-+20°С), при цьому охолодження тривало 3-4 год. Саме за такий проміжок часу відбувається мобілізація захисних сил організму, направлених на підвищення резистентності до охолодження ?3, 55?.
Нами подано заявку на винахід "Спосіб моделювання загальної глибокої гіпотермії в експерименті" (пріоритет від 12 серпня 2003 р. за № 2003065678).
2.2. Ін'єкційний метод дослідження кровоносного русла міокарда різних відділів серця щурів у нормі та на етапах постгіпотермічного періоду
Для вивчення внутрішньоорганних кровоносних судин міокарда різних відділів серця щурів ми використовували ефірно-хлороформну суміш паризької синьої (10 г фарби на 100 мл розчинника, який складався з ефіру і хлороформу у співвідношенні 3:1). Цю суміш ін'єкували антеградно в цибулину аорти. Через 3-4 год після закінчення заповнення кровоносних судин вище зазначеною сумішшю, проводили забір шматочків міокарда різних відділів серця і фіксували в 12% розчині нейтрального формаліну протягом 14-ти діб.
На заморожуючому мікротомі виготовляли зрізи, товщиною 30-50 мкм, які зневоднювали в спиртах зростаючої концентрації, просвітлювали в метиленовому ефірі саліцилової кислоти і заключали в полістирол. У подальшому вивчали під бінокулярним мікроскопом МБР-3 при різних збільшеннях.
Для оцінки взаємної топографії кровоносних судин та кардіоміоцитів частину ін'єкованого матеріалу, після його фіксації в 12% розчині нейтрального формаліну, ми використали для приготування гістологічних зрізів із наступним фарбуванням їх гематоксиліном і еозином.
2.3. Гістологічні дослідження стінки кровоносних судин, ланок ГМЦР і кардіоміоцитів серця в нормі та в різні терміни після дії загальної глибокої гіпотермії
Після забору шматочків міокарда різних відділів серця, матеріал фіксували в 12% розчині нейтрального формаліну. Через 14 діб його проводили до парафінових блоків за загальноприйнятою методикою. На санному мікротомі отримували зрізи товщиною 5-8 мкм, з наступним фарбуванням їх фукселін-пікрофуксином, гематоксиліном і еозином. Відтак дослідження проводили під мікроскопом МБР-3 при різних збільшеннях (окуляр 10, об'єктив 8-20-40-90).
2.4. Електронномікроскопічне дослідження ланок ГМЦР, кардіоміо-цитів та міоендокринних клітин серця в нормі і після дії загальної глибокої гіпотермії
При заборі матеріалу для електронномікроскопічного дослідження дотримано загальноприйнятих правил швидкості висікання та атравматичності.
Шматочки міокарда різних відділів