РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Для вирішення поставлених завдань проведено 16 серій експери-ментів. У роботі використано 235 самців білих щурів з масою тіла 0,14-0,16 кг.
2.1. Характеристика експериментальних моделей, що використовувалися в роботі.
Для вивчення впливу на гемостаз екзогенного мелатоніну проведена серія дослідів на тваринах, яким внутрішньочеревинно вводили по 778 мкг мелатоніну на 1 кг маси тіла в 0,5 мл розчинника 4 рази на добу протягом 5 діб, останнє з яких здійснювали за 2 год до евтаназії щурів.
Моделювання гіпертиреозу проводили шляхом щоденного внутрішньошлункового введення щурам L-тироксину у дозі 200 мкг/кг маси тіла протягом 14 діб [77]. Гіпотиреоз викликали введенням мерказолілу у дозі 10 мг/кг маси тіла протягом 10 діб [15]
Епіфізектомію проводили під нембуталовим наркозом (40 мг/кг маси тіла) за методикою Y.Kitay, M.Altschule (1954) у модифікації В.П.Пішака [82]. Тварин фіксували на операційному столику спинкою догори. Операційне поле депілювали, обробляли спиртом. Розрізали шкіру і виконували трепанацію черепа таким чином, щоб кісткова пластинка своїм заднім кінцем зберігала зв'язок з м'язами. Після видалення епіфіза кровотечу зупиняли гемостатичною губкою. У рану насипали антибіотик. Кісткову пластинку укладали на місце, розріз шкіри зашивали шовком. Післяопераційна смертність тварин складала 8-10 %.
Енуклеацію, або осліплення щурів, проводили під нембуталовим наркозом (40 мг/кг маси тіла), у кон'юнктивний мішечок вводили 0,1% розчин дикаїну, після чого видаляли очне яблуко (Кучук О.П.,2001). Післяопераційна смертність тварин складала 2 %.
2.2. Методи дослідження регуляції агрегатного стану крові.
У всіх серіях досліджувалися тромбоеластографічні характеристики інтенсивності згортання крові і структурних параметрів кров'яного згустку на тромбоеластографі "АКГМ-01" (Росія).
Кров забирали з черевної аорти силіконованим шприцем, стабілізували цитратом натрію (1:9), центрифугували при 3000 об/хв і відокремлювали плазму від формених елементів.
З використанням реактивів фірми "Simko Ltd." (Україна) визначали стан ферментативного і неферментативного фібринолізу в плазмі крові. Принцип методу полягає в тому, що при інкубації азофібрину зі стандартною кількістю плазміногену в присутності активаторів та інгібіторів фібринолізу, які містяться у плазмі крові, утворюється плазмін, активність якого оцінюється за ступенем забарвлення розчину в лужному середовищі при лізисі азофібрину в присутності ?-амінокапронової кислоти (неферментативний фібриноліз) або без неї (сумарна фібринолітична активність). Різниця між ними відповідає інтенсивності ферментативного фібринолізу [71].
Подібним чином, але без використання плазміногену і ?-амінокапронової кислоти, визначали протеолітичну активність плазми крові, використовуючи колорогенні сполуки: азоальбумін (лізис низькомолекулярних білків), азоказеїн (лізис великомолекулярних білків), та азокол (лізис колагену) (Simko Ltd., Україна) [35].
Азоказеїн, aзоальбумін та aзокол - ліофільно висушені препарати від оранжового до темно-вишневого кольору, отримані відповідно з казеїну за Гаммерстеном та бичачого сироваткового альбуміну шляхом обробки діазонієвою сіллю сульфанілової кислоти.
Препарати добре розчинні в буферних розчинах з рН 6,0 і вище. Азоказеїн, азоальбумін та азокол застосовують як субстрати для визначення активності протеїназ в лужному середовищі. Загальна схема визначення протеолітичної активності з використанням даних препаратів полягає в наступному. До 100 мкл плазми крові у боратному буфері (рН 9.0) додавали 100 мкл 0,5 %-ного розчину субстрату в тому ж буферному розчині та інкубували 30 хвилин при 37 0С. Реакцію зупиняли додаванням 0,5 мл 10%-ного розчину трихлороцтової кислоти. Через 10 хвилин суміш центрифугували або фільтрували. До відібраної проби (0,5 мл) супернатанта додавали рівний об'єм 0,5 М розчину NaOH і визначали світлопоглинання отриманої суміші при 440 нм. Як контроль використовували пробу, котра замість плазми крові містила таку ж саму кількість буферного розчину.
Силіконування посуду проводили у витяжній шафі. Сухі чисті пробірки, колби, піпетки, шприци та голки заповнювали 5 % розчином дихлордиметилсилану або трихлорметилсилану в толуолі (силікон ) на 5-10 хвилин. Посуд висушували при температурі 180-200 оС.
2.3. Методи дослідження біохімічних змін у тканинах внутрішніх органів.
Тканини внутрішніх органів (серце, нирки) одразу після декапітації щурів заморожували в рідкому азоті. Наважки тканин органів гомогені-зували в 2,0 мл боратного буферу (рН 9.0) і надалі використовували в біохімічному аналізі.
Протеолітичну активність 1 %-них гомогенатів тканин внутрішніх органів визначали за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу ("Simko Ltd", Україна) [71]. Принцип методу полягає в тому, що при інкубації білкових азосполук у присутності активаторів та інгібіторів протеолізу, які містяться у тканинах, відбувається лізис азоальбуміну (деградація низькомолекулярних протеїнів), азоказеїну (лізис високомолекулярних білків) та азоколу (колагеноліз), інтенсивність якого оцінюється за ступенем забарвлення інкубаційного середовища.
Визначення сумарного, ферментативного і неферментативного фіб-ринолізу в тканинах внутрішніх органів проводили за лізисом азофібрину ("Simko Ltd", Україна): при інкубації азофібрину із стандартною кількістю плазміногену в присутності активаторів та інгібіторів фібринолізу, які містяться у тканинах, утворюється плазмін, а інтенсивність фібринолізу оцінюється за ступенем забарвлення розчину в лужному середовищі в присутності ?-амінокапронової кислоти (неферментативний фібриноліз), або без неї (сумарна фібринолітична активність). Різниця між ними відповідає інтенсивності ферментативного фібринолізу [71].
Результати досліджень опрацьовували методами варіаційного ста-тистичного аналізу з визначенням критерію Ст'юдента за програ