РОЗДІЛ 2
ЗАГАЛЬНА МЕТОДИКА ТА ОСНОВНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Робота виконувалась у 1998-2003 рр. у лабораторії контролю препаратів при незаразних захворюваннях та імунології ДНДКІ ветпрепаратів та в навчально-дослідному господарстві "Комарнівське" Львівської державної академії ветеринарної медицини імені С.З.Гжицького Городоцького району Львівської області.
В основі методологічного вибору напрямку дисертаційної роботи були матеріали літератури щодо розробки нового препарату для лікування корів хворих на ендометрит із метою поглибленого вивчення патогенезу ендометритів у корів. Саме тому дослідження були спрямовані на вивчення особливостей перебігу ендометриту у молочних корів, його гормональної регуляції та інших показників метаболізму крові. Крім того, на мікроорганізмах, щурах і коровах вивчалась фармакотоксикологічна дія новоствореного препарату "Ендодек".
При визначенні конкретного напрямку роботи ми припускаємо, що лише комплексна оцінка показників (у матці: видового складу мікроорганізмів, у крові: гормонального статусу, кількості еритоцитів, лейкоцитів, концентрації загального білка,сечовини, цукру, рівня гемоглобіну, перекисного окиснення ліпідів; активності ферментів: КТ, АсАТ, АлАТ, ЛДГ, МДГ, СДГ) в організмі тварин у нормі та при ендометриті дозволить розширити та доповнити знання про механізми розвитку ендометриту на рівні цілого організму, а також установити терапевтичну ефективність новоствореного препарату "Ендодек" при цій патології за такими показниками: видовий склад мікрофлори матки, появою першої охоти після отелення, кратністю осіменіння та запліднення корів, індексами осіменінь і запліднень, перебігу наступної тільності, отелення та після отелення, масою народжених телят, виділення посліду та лохій, рН навколоплідної рідини, маси фетальної плаценти, кількості та площі котиледонів, кількості, висоти та товщини ворсинок, лізисом жовтого тіла, субінволюцією матки, сервіс-періодом.
2.1. Тварини для експериментів, схеми дослідів та методи досліджень
Схема проведення досліджень подана на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Схема проведення досліджень
Метою роботи було вивчити окремі аспекти розвитку та перебігу післяродового гнійно-катарального ендометриту у корів та його динаміки при лікуванні новоствореним препаратом "Ендодек". Розроблений препарат, рекомендований для лікування корів, хворих на ендометрит. Виходячи із сучасних досягнень у технології лікарських форм, нами в ДНДКІ ветпрепаратів застосовано нові методичні підходи щодо створення препарату у формі супозиторіїв. На перший план було поставлено вивчення активності протизапальної дії препарату, здатність його проявляти антисептичну дію у матці і знешкоджувати токсини, які виділяють мікроби.
2.1.1. Досліди на мікрооганізмах
2.1.1.1. Встановлення бактеріостатичної дії субстанцій, які входять до складу нового препарату
Дослідження проводились згідно з методикою визначення бактеріостатичної та бактерицидної концентрації антибактеріальних препаратів методом серійних розведень [164].
Бактеріостатичну дію декаметоксину, диоксидину та анаприліну окремо взятих та в комбінації всіх трьох складників (субстанцій) препарату "Ендодеку" визначили методом серійних розведень у рідкому живильному середовищі (МПБ). Цей метод дозволяє визначати мінімальні бактеріостатичні та максимальні бактерицидні концентрації антибіотиків у відношенні до культур мікроорганізмів, що досліджуються.
Для визначення бактеріостатичної й бактерицидної концентрації використовували:
- стандартні живильні середовища, які забезпечують оптимальні умови росту мікроорганізмів, що досліджуються і не містять речовин, які пригнічують дію антибактеріальних препаратів;
- розчини антибактеріальних препаратів у потрібній концентрації;
- завись добової культури мікроорганізмів.
Для пригнічення росту мікроорганізмів необхідні різні концентрації антибактеріальних препаратів, саме тому для кожного препарату готували окрему серію розведень. З цією метою використовували основні розчини антибактеріальних препаратів, які містять у 1 мл розчину 1 мг антибактеріального препарату.
В якості розчинника використовували стерильний ізотонічний розчин натрію хлориду. З основних розчинів отримували робочі розчини антибактеріальних препаратів, необхідні для приготування рядів двократних послідовних розведень.
Культури мікроорганізмів вирощували на м`ясо-пептонному агарі (МПА). Із 18-24 годинної культури мікроорганізмів готували завись за оптичним стандартом мутності, яку розводили стерильним ізотонічним розчином натрію хлориду до концентрації 500 млн. мікробних клітин у 1 мл.
У штатив ставили 14 стерильних пробірок і в кожну наливали по 4,5 мл МПБ. У першу пробірку вносили 4,5 мл основного розчину антибактеріального препарату. Суміш старанно перемішували та при цьому набирали її у піпетку і видували у пробірку. Після цього 4,5 мл рідини переносили з першої пробірки в другу, знову перемішували, тоді переносили 4,5 мл суміші з другої пробірки в третю і так дальше до 13 пробірки включно. З 13-ї пробірки зайві 4,5 мл зливали. При такому методі розведення у всіх 13 пробірках знаходилось по 4,5 мл суміші. При цьому кожна пробірка ряду містила антибактеріального препарату у два рази менше, ніж попередня. При такому розведенні інтервал концентрацій складав від 500 мкг/мл у першій пробірці до 0,1 мкг у 13. Чотирнадцята пробірка, яка не містила антибактеріальний препарат, використовувалась як контроль росту культури.
Після приготування ряду розведень антибактеріального препарату у кожну із 14 пробірок додавали по 0,5 мл. приготовленої зависі мікроорганізмів.
Пробірки інкубували в термостаті при температурі 37о С протягом 18-20 годин. Після цього проводили облік результатів реакції. З цією метою переглядали вміст усіх пробірок. Відзначали наявність або відсутність у них росту мікроорганізмів ДСТУ EN 6887-1:2001 [164]