РОЗДІЛ 2
ВИБІР НАПРЯМКІВ ДОСЛІДЖЕНЬ, МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ВИКОНАННЯ РОБОТИ
2.1. Проведення клінічних досліджень
Дослідження проводилися упродовж 2001 - 2003 років на базі кафедри патологічної анатомії Національного аграрного університету, патоморфологічного відділу Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини, а також у CВАТ АК "Калита" Броварського району Київської області. Комплекс промислового типу по відгодівлі свиней потужністю 108 тис. голів є господарством із замкнутим циклом. У господарстві застосовується поточний метод виробництва і дотримується строга ритмічність виробничих процесів.
Клінічний огляд 679 поросят віком 2 - 4 місяці проводили загальноприйнятими методами. З них 273 хворіли на атиповий пастерельоз, 295 - на типову форму хвороби. Для контролю було використано 111 клінічно здорових поросят того ж віку.
При проведенні клінічного огляду звертали увагу на загальний стан тварин, їх реакцію на зовнішні подразники, наявність апетиту і спраги, стан шкіри і видимих слизових оболонок, частоту дефекацій і характер фекалій. Частоту і характер дихання та серцебиття визначали аускультацією. Термометрію проводили ртутним термометром.
2.2. Проведення патоморфологічних досліджень
Було проведено патолого-анатомічний розтин 22 трупів тварин, які загинули при типовому перебігу пастерельозу, 15 трупів поросят, які загинули при атиповому перебігу хвороби, і 9-ти контрольних, клінічно здорових поросят. Всі тварини були віком від 2-х до 4-х місяців.
Розтин проводили методом часткової евісцерації в загальноприйнятій послідовності [54].
Для гістологічних і гістохімічних досліджень відбирали шматочки легень, тимуса, лімфовузлів поверхневих (привушних, нижньощелепних, латеральних заглоткових, дорсальних і вентральних поверхневих шийних, поверхневих пахвинних, підклубових) та глибоких (краніальних середостінних, біфуркаційних, підшлунково-дванадцятипалокишкових, порожньої кишки, клубово-ободовокишкових, печінкових), печінки, селезінки, нирок, серця, надниркової залози, шлунка (кардіальної, пілоричної частини та дна шлунка), різних відділів кишечника (середньої частини дванадцятипалої і клубової кишок, середньої частини краніальної, середньої і каудальної третин порожньої кишки, середньої частини краніальної та каудальної половин сліпої, ободової і прямої кишок), підшлункової і щитоподібної залоз, сечового міхура, головного і спинного мозку. Відібрані шматочки фіксували в 10 % нейтральному водному розчині формаліну за прописом Ліллі та в рідині Карнуа. Після фіксації з шматочків виготовляли зрізи товщиною 15 - 20 мкм на заморожувальному мікротомі, заливали їх через хлороформ у парафін і за допомогою санного мікротому одержували зрізи товщиною 3 - 10 мкм [109].
Гістологічну будову органів і тканин вивчали при фарбуванні зрізів гематоксиліном Караці та еозином. Компоненти сполучної тканини виявляли методом ван-Гізон [80].
Гістохімічні методи включали ідентифікацію фібрину, нуклеїнових кислот, білків, ліпідів, протеогліканів, глікопротеїнів та глікогену [80, 93, 99, 140].
Фібрин фарбували за Грамом-Вейгертом [93].
Одночасне виявлення ДНК і РНК проводили фарбуванням ГХГ та ТС, які приблизно однаково адсорбуються ДНК і РНК. Розчин галоціаніну і хромових галунів готували за прописом Ейнарсона (рН 1,64), час фарбування - 24 - 48 годин. Розчин ТС застосовували в 0,2 %-ній концентрації на оцтовому буфері при рН 4,2, час фарбування - 30 хвилин [61, 79, 152, 214].
ДНК виявляли реакцією Фельгена-Росенбека [93]. При цьому враховували дані про її специфічність [43, 243] і характер контролів [276]. Реактив Шифа для виявлення ДНК готували за прописом Д.Томазі [140]. Гідроліз проводили в 1Н НСІ при 600 С 12 хвилин, фарбування - 1 годину.
При дослідженні білкових речовин застосовували методи виявлення основних, кислих та сумарних білків. Останні ідентифікували в реакції з амідочорним 10 В [80]. При диференціації основних і кислих білків враховували, що їх основні властивості обумовлені переважанням у складі їх молекул аміногруп над карбоксильними групами. В молекулах кислих білків кількість карбоксильних груп переважає над кількістю аміногруп [99, 140]. Для одночасного виявлення у гістологічних зрізах основних і кислих білків використовували метод Мікель-Кальво [80].
Нейтральні жири виявляли фарбуванням заморожених зрізів суданом 3 за Дадді (їх локалізацію визначали за червоно-помаранчевим або помаранчево-жовтим забарвленням) [109]. Загальні ліпіди - методом Лізона у заморожених зрізах з використанням насиченого розчину судану В на 70 %-ному етанолі [140]. Проте, більшість ліпідів у тканинах і клітинах зв'язані з іншими речовинами - білками, вуглеводними сполуками, металами та ін. [90]. Зв'язані ліпіди визначали в парафінових зрізах 2 %-ним розчином судану чорного В в абсолютному ацетоні за Беренбаумом [80].
Дослідження вуглеводних біополімерів включало виявлення протеогліканів, глікопротеїнів і глікогену [99, 188].
Молекула протеоглікану складається з білкової і полісахаридної частин, з'єднаних міцним ковалентним зв'язком. Полісахаридна частина представлена ГАГ - лінійними полімерами, які складаються з дисахаридних одиниць. Кожна з цих одиниць містить гексозамін і гексуронову кислоту (або галактозу). Ця група сполук включає гіалуронову кислоту, хондроїтин-4-сульфат, хондроїтин-6-сульфат, дерматан-сульфат, кератан-сульфат, гепаран-сульфат та гепарин [73, 227, 267,277].
Протеоглікани виявляли шляхом ідентифікації їх ГАГ реакцією метахромазії з ТС (1 : 1000) при рН 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,2; 5,0; 6,0 [275]. Метахромазію при рН нижче 4,0 в основному дають сульфатовані протеоглікани [21]. Гіалуронова кислота фарбується при рН вище 4,5 [22].
ГАГ також диференціюються фарбуванням альціановим синім [99, 249]. При рН 1,0 фарбуються лише сульфатовані протеоглікани, а при рН 2,5 і вище - головним чином їх карбоксильні групи. Цей метод має високу чутливість. На його результати не впливають зміни полім