ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальное исследование проведено на 360 белых беспородных крысах-самцах, полученных из вивария Луганского государственного медицинского университета. Во время эксперимента лабораторные животные содержались в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для эксперимента и научных целей (Страсбург, 1986 г.). Эксперимент проводился в осенне-зимний период года. До и после эксперимента крысы находились в помещении вивария при температуре воздуха 20-22C?, влажности не более 50%, в стандартных пластиковых клетках (не более 6 особей в каждой), на стандартном рационе [57].
В зависимости от возраста животные были разделены на три равные серии (Таб. 2.1) [93]. Первую серию составили неполовозрелые крысы с исходной массой 30-40 г. (в возрасте 4 недель). Вторую серию составили половозрелые крысы с исходной массой 130-150 г. (в возрасте 4 месяцев). В третью серию вошли животные периода старческих изменений с исходной массой 330-350 г. (в возрасте 18 месяцев). Животных каждой серии подразделяли на группы в зависимости от действующих на них агентов. Первую группу составили крысы, перенесшие тимэктомию. Во вторую группу вошли животные, подвергшиеся операции ложной тимэктомии. Крысы, которым внутрибрюшинно вводили тимоген, составили третью группу. Контрольные животные, получавшие физиологический раствор хлорида натрия - четвертую группу. Крыс каждой группы распределяли на подгруппы в зависимости от длительности эксперимента. Сроки наблюдения составили 7, 15, 30, 90 и 180 суток.
Тимэктомию производили у крыс всех серий хирургическим способом. После эфирного наркоза крыс закрепляли на столике в положении на спине. Линию будущего разреза смазывали 2% раствором дикаина. Скальпелем для глазных операций разрезали кожу и поверхностную фасцию от нижнего края
перстневидного хряща до средней трети грудины. По линии разреза тупо раздвигали мышцы шеи и прямыми ножницами для глазных операций строго по средней линии рассекали грудину. Разведя края раны, тупо отслаивали тимус от прилежащих сосудов и сердца. Обе доли железы удаляли при помощи пинцета. Рану зашивали шелковыми нитками. Поверхность разреза смазывали настойкой йода. Полноту удаления тимуса контролировали макроскопически при вскрытии животных и с помощью гистологического анализа клетчатки переднего средостения.
Животные второй группы подвергались ложной тимэктомии. При этом сохранялись все этапы операции кроме удаления вилочковой железы.
Крысы третьей группы получали препарат, оказывающий иммуномодулирующее действие (усиление сниженной активности иммунной системы и уменьшение неадекватно высокого иммунного ответа). Был использован тимоген производства ОАО "Днепрофарм" Украина П/96/158/6. Он представляет собой синтетический дипептид глутамил-триптофан, идентичный природному соединению, выделенному хроматографическим методом из экстракта вилочковой железы. Известно, что тимоген активирует дифференцировку Т-лимфоцитов, восстанавливает соотношения иммунорегуляторных клеток и функциональную активность системы неспецифической защиты. В настоящее время тимоген широко применяется в клинической практике для нормализации реакций клеточного и гуморального иммунитета, стимуляции процессов регенерации, восстановления биохимических и гематологических показателей крови при иммунодефицитных состояниях, активизации синтеза эндогенного интерферона. Препарат вводился животным ежедневно в утренние часы (в течение 10 дней), внутрибрюшинно в дозе 1мкг/кг массы тела. Расчёт дозировки вводимого лекарственного препарата осуществляли по формуле: доза крысы = 3,62 ? доза человека / 0,57. В данной формуле доза для человека соответствует применяемой в клинической практике.
Животным четвертой группы вводили внутрибрюшинно эквивалентное по объему количество физиологического раствора хлорида натрия по той же схеме.
По истечении сроков эксперимента животных декапитировали под эфирным наркозом в соответствии с "Методическими рекомендациями по выведению животных из эксперимента" (1985). Выделяли щитовидную железу вместе с трахеогортанным комплексом c помощью пинцета для экстракции щитовидной железы у мелких лабораторных животных (Декларационный патент № 61509А), препарировали, проводили ее макроскопический анализ. Изучали следующие органометрические показатели: длину, ширину, толщину доли органа с помощью окуляр-микрометра МОВ - 1 - 15 ГОСТ 7865-56 и окулярной измерительной сетки микроскопа БМП-3 [99]. Калибровку измерительных приборов осуществляли с помощью миллиметрового отрезка ГОСТ 7513-55 [44]. Объем вычисляли по формуле: V=abc?/6, где а - длина доли, b - ширина доли, с - ее толщина [4]. Массу органа определяли при помощи аналитических весов ВЛА-200 с точностью до 1 мг. Затем щитовидную железу фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Проводку материала осуществляли по стандартной схеме путем обезвоживания в спиртах возрастающей концентрации и удаления спирта с помощью ксилола. Образцы заливали в парафин. Из полученных блоков на микротоме МС-2 изготавливали парафиновые срезы толщиной 4-5 мкм, окрашивали их гематоксилин-эозином и исследовали под бинокулярным микроскопом Olympus BX-41 (Япония).
Количественный морфометрический анализ каждого гистологического препарата проводился по 6 полям зрения стандартной площади на аппаратно-программном комплексе состоящем из микроскопа Olympus ВХ-41, адаптеров OLYMPUS С 3040-ADV и USMAD-3, цифрового фотоаппарата OLYMPUS С- 5050 (Япония) и компьютера ATHLON 2,2 Ггц. Таким образом, в каждой группе животных исследовалось 36 полей зрения (для которых приведены данные по количеству фолликулов), а в целом изучалось 2160 полей зрения. Цифровые изображения с разрешением 5 млн пикселей и глубиной цвета 24 бит записывались на CD-диски, далее обрабатывались программой "Morpholog Light - Thyroid" (Рис. 2.1). Вначале каждое изображение приводилось к реальному размеру с помощью калибр