Ви є тут

Роль порушень ліпідного обміну та ендотеліальної дисфункції у прогресуванні хронічної ниркової недостатності

Автор: 
Кудря Олександр Вікторович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2004
Артикул:
0404U003885
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Описание использованных методов
Все пациенты, участвующие в исследовании, прошли стандартное клинико - лабораторное обследование, которое включало: клинические анализы крови и мочи, анализы мочи по Зимницкому и Нечипоренко, исследование мочи на суточную протеинурию; определение уровней креатинина и мочевины, скорости клубочковой фильтрации, концентрации электролитов крови и белка, определение титра антител к базальной мембране клубочков; ультразвуковое исследование (УЗИ) почек, электрокардиограмму (ЭКГ), внутривенную урографию, рентгенограмму органов грудной клетки. У 6 больных диагноз был верифицирован с помощью пункционной биопсии почек.
Для изучения параметров липидного метаболизма накануне исследования в 19 час. больной получал легкий ужин без содержания жиров. На следующий день в 8 час. 30 мин. производили забор крови в пробирку, содержащую ЭДТА. Плазму отделяли от форменных элементов центрифугированием при 3000 об/мин в течение 3 минут и использовали для анализа немедленно или хранили при температуре 4?С, но не более 24 часов. Руководствуясь рекомендациями экспертов ВОЗ для липидных лабораторий, общий холестерин плазмы крови определяли с помощью многоступенчатого метода в модификации L.L. Abel и соавт. [138] в описании В.Г. Колба и В.С. Камышникова [139]. Принцип метода заключается в том, что холестерин гидролизуется холестеролоксидазой до холест-4-ензенола, который в присутствии пероксидазы хинониминовым красителем окрашивается в розовый цвет. Концентрация хинонимина прямо пропорциональна концентрации холестерина в пробе и определяется фотометрическим методом.
Концентрация триглицеридов плазмы крови определяли по содержанию в них глицерина. Глицерин образуется при гидролизе триглицеридов липазой и в присутствии АТФ и глицерокиназы фосфорилируется, превращаясь в глицерил-3-фосфат, который в присутствии пероксидазы хинониминовым красителем окрашивается в розовый цвет. Концентрация хинонимина прямо пропорциональна концентрации триглицеридов в пробе и определяется фотометрическим методом [140].
Для определения холестерина в составе липопротеидов высокой плотности использовали cтандартный набор реактивов фирмы Olvex Diagnosticum (Россия). Принцип метода заключается в том, что хиломикроны, липопротеиды низкой плотности и липопротеиды очень низкой плотности осаждаются при добавлении к образцу фосфорновольфрамовой кислоты и Mg?+ . После центрифугирования в супернатанте остаются только липопротеиды высокой плотности, концентрация которых определяется так же, как и концентрация общего холестерина [141].
Холестерин липопротеидов низкой плотности определяли с помощью уравнения Фридвальда [142]. Использование данной формулы считается уместным при соблюдении трех основных условий [143]:
1. Концентрация триглицеридов в анализируемых образцах должна быть меньше 400 мг/дл (4,66 ммоль/л).
2. В анализируемых образцах должны отсутствовать хиломикроны, т.е. кровь может отбираться только в состоянии натощак.
3. Образцы не должны содержать бета-ЛОНП ("плавающих" бета-липопротеинов, характерных для гиперлипопротеидемии III типа).
Концентрацию ХС ЛНП рассчитывают по формуле Фридвальда следующим образом: ХС ЛНП = ОХС - ХС ЛВП - (триглицериды /5), где все концентрации выражены в мг/дл, а параметр триглицериды /5 отражает концентрацию ХС ЛОНП. Если концентрации выражены в ммоль/л, то уровень ХС ЛОНП расчитывают как триглицериды /2,22.
Концетрации АПО - А1 и АПО - В определяли в сыворотке крови иммунотурбидиметрическим методом с помощью стандартных наборов реактивов фирмы HUMAN (Германия) согласно рекомендациям J.C. Fruchart [144]. Наборы для определения АПО - А1 и АПО - В состоят из монореагента (поликлональные антитела к АПО - А1 или АПО - В человека) и АПО - А1/АПО - В стандарта (жидкая, стабилизированная, человеческая плазма). АПО - В антигены в пробах и стандарте вызывают иммунологическую агглютинацию с антителами к АПО - В в реагенте. Степень агглютинации пропорциональна концентрации АПО - В в пробе и может быть измерена турбидиметрическим методом. Абсолютно идентично определяется АПО А - 1, за тем лишь исключением, что монореагент содержит поликлональные антитела не к АПО - В, а к АПО А -1.
Содержание в плазме крови эндотелина-1 определяли с помощью системы Biotrak tm endothelin-1 ELISA фирмы Amersham Pharmacia Biotech (Великобритания), которая была специально создана только для исследовательских целей. Материалом для исследования служила венозная кровь, которую собирали утром, в состоянии натощак в пробирку объёмом 5 мл., содержащую литиум - гепарин. Кровь центрифугировали немедленно со скоростью 2000 об/мин в течение 10 мин. при температуре 4°С. Полученную таким образом плазму хранили при температуре -18°С вплоть до момента исследования, но не более 2-х месяцев.
Система для определения ЭТ-1 содержит меченные пероксидазой Fab фрагменты антител к эндотелину-1, которые иммобилизированы в специальной микротитровочной посуде и стабилизированы субстратным раствором (ТМВ) [145]. Преимуществом данной системы является то, что она позволяет быстро, без применения изотопных материалов определять концентрацию эндотелина в диапазоне от 23,8 - 797,4 pg/ml (1 - 32 fmol/well) [146]. Один набор позволяет произвести 40 определений ЭТ-1, которые ставятся в дублях (парами).
Определение ЭТ-1 происходит с помощью метода, именуемого как двухсторонний иммуноферментный "сэндвич" [147]. Стандарты и пробы инкубируются в микротитровочной посуде с антителами к ЭТ-1, в результате чего происходит связывание эндотелина, а все побочные продукты вымываются или аспирируются. Для того, чтобы произвести количественную оценку имеющегося связанного ЭТ-1, к пробе добавляют меченные пероксидазой Fab фрагменты антител к эндотелину-1. Количество пероксидазы соответствует количеству ЭТ-1. Содержание пероксидазы определяется путем добавления ТМВ (