ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Получение эритроцитов
Эритроциты получали из свежеконсервированной донорской крови, заготовленной на
глюгицировом консерванте. Кровь получали на Харьковской областной станции
переливания крови. С целью унификации объекта, в работе использовали кровь
мужчин II группы. После удаления плазмы эритромассу трижды отмывали путем
центрифугирования при 1500 g в течение 3 мин в 10-кратном объеме
физиологического раствора
(0,15 Моль/л хлорид натрия, 0,01 Моль/л трис-буфер, pH 7,4). Лейкоцитарную
пленку и супернатант удаляли методом аспирации. Осадок эритромассы содержал в
среднем 80 % клеток. Эритроциты в виде плотного осадка хранили при 4 °С и
использовали в течение 4 часов.
Постгипертонический лизис эритроцитов
Постгипертонический лизис эритроцитов в средах с различным составом.
Упакованные эритроциты разводили гипертоническим раствором, содержащим 1,5 или
3,0 Моль/л хлорида натрия (в соотношении 1:10 и 5 мкл получившейся суспензии
переносили в изотонические среды объёмом 2 мл следующего состава (рН 7,4):
0,15 Моль/л хлорид натрия;
0,125 Моль/л хлорида натрия+0,05 Моль/л сахароза;
0,1 Моль/л хлорида натрия+0,1 Моль/л сахароза;
0,05 Моль/л хлорида натрия+0,2 Моль/л сахароза;
0,025 Моль/л хлорида натрия+0,25 Моль/л сахароза;
0,01 Моль/л хлорида натрия+0,28 Моль/л сахароза;
0,3 Моль/л сахароза;
0,15 Моль/л пируват натрия;
0,1 Моль/л сульфат натрия;
0,1 Моль/л трёхзамещённый цитрат натрия;
Время экспозиции клеток в среде, содержащей 1,5 Моль/л хлорида натрия
составляло 45 минут, 3 Моль/л – 8-10 секунд, в изотонических средах – 3 минуты,
температура инкубации в гипертонии и изотонии составляла 22 ?С. Уровень
гемолиза определяли спектрофотометрически.
2. Постгипертонический лизис эритроцитов в гипотонических средах.
Контролем для данного эксперимента служил гипотонический гемолиз. Упакованные
эритроциты разводили гипертоническим раствором, содержащим 0,6, 0,8 или 1,5
Моль/л хлорида натрия (в соотношении 1:10) и 5 мкл получившейся суспензии
переносили в гипотоническую среду объёмом 2 мл (рН 7,4). Также данные
гипотонические среды использовались в комбинации с ингибиторами анионного
транспорта (ДИДС и дипиридамол). Время экспозиции эритроцитов в гипертонических
средах составляло 8-10 секунд, температура инкубации в гипертонии и изотонии
составляла 22 ?С. Уровень гемолиза определяли спектрофотометрически.
3. Постгипертонический лизис эритроцитов после инкубации, предшествующей
инкубации в гипертонии.
По 70 мкл осадка эритроцитов (с гематокритом 70 %) переносили в 30 мкл среды
прединкубации на 1 минуту:
1. 0,15 Моль/л хлорид натрия;
2. 0,45 Моль/л хлорид натрия;
3. 0,15 Моль/л хлорид натрия+0,4 Моль/л сахароза;
4. 0,15 Моль/л хлорид натрия+15 % ПЭГ-1500).
После этого отбирали аликвоты клеточной суспензии по 10 мкл и переносили в
гипертонические среды на 10 сек.:
3 Моль/л хлорид натрия (для сред прединкубации 1 и 2);
3,0 Моль/л хлорид натрия +0,4 моль/л сахарозы (для среды прединкубации 3);
3,0 Моль/л хлорид натрия +15 % ПЭГ-1500 (для среды прединкубации 4);
к которым затем добавляли регидратирующие среды объёмом 1 мл с различными
значениями рН (5,8; 6,6; 7,4), инкубировали 5 мин., центрифугировали 3 мин. и
измеряли уровень гемолиза в надосадке спектрофотометрическим методом.
В ряде экспериментов регидратирующие среды с эритроцитами после 5-минутной
инкубации разводили в 10 раз физиологическим раствором с соответствующим рН и
инкубировали ещё 10 мин. с последующим центрифугированием. Далее супернатант
удаляли, а к осадку эритроцитов, сохранившихся в процессе ПГЛ, добавляли 1 мл
0,04 % тритона Х-100 и измеряли уровень гемолиза в пробах
спектрофотометрическим методом. Высчитанные величины отнимали от 100 % и
получали уровень гемолиза в исходных пробах. Все эксперименты проводились при
комнатной температуре (22 0С).
Гипотонический гемолиз эритроцитов
Эритроциты разводили физиологическим раствором в соотношении 1:10 и 5 мкл
получившейся суспензии переносили в гипотоническую среду с различными
значениями рН 5,8; 6,6; 7,4. Осмолярность гипотонической среды для каждого
эксперимента подбиралась таким образом, чтобы при рН 7,4 уровень
гипотонического повреждения соответствовал 50 %. В среднем она составляла 0,067
Моль/л хлорида натрия.
Гипертонический криогемолиз эритроцитов
Эритроциты с конечным гематокритом 2 % добавляли в растворы, содержащие 0,86
Моль/л сахарозу, 1,2 Моль/л хлорид натрия (в присутствии и отсутствии 50
мкМоль/л нигерицина), инкубировали 0-60 минут при 37 0C и охлаждали на ледяной
бане 5 минут. После охлаждения пробирки с суспензией эритроцитов
центрифугировали при комнатной температуре 3 минуты, 1500 g.
Определение уровня гемолиза эритроцитов спектрофотометрическим методом.
Клетки осаждали центрифугированием в течение 3 мин при 1500 g. Содержание
вышедшего в супернатант гемоглобина определяли спектрофотометрическим способом
на СФ-4А с проточной кюветой на длине волны 543 нм. За 100 % принимали
поглощение пробы, в которую добавляли детергент тритон Х-100 в концентрации 0,1
%.
Определение уровня и динамики гемолиза эритроцитов.
В работе была использована установка для измерения светорассеяния клеточных
суспензий (расходимость светового пучка 3°), созданная на базе монохроматора
СФ-4А [12, 13, 158].
Уровень гемолиза эритроцитов регистрировали методом светорассеяния, т.е.
уровень гемолиза определяли путём регистрации изменения оптической плотности
(ОП) суспензии эритроцитов при длине волны 720 нм. Концентрация клеток в кювете
подбиралась таким образом, чтобы уровень оптической плотности суспензии
составлял 0,25 - 0,3 единице опти
- Київ+380960830922