РОЗДІЛ 2. МатеріалИ і методи дослідженНЯ
2.1 Умови опромінення тварин
Мишей опромінювали у летальній дозі (9 Гр, LD 100/13) на установці РУМ-17 у
коробках з органічного скла з індивідуальними комірками для кожної миші. Умови
опромінення були такі: U - 220 кВ, I - 10 мА, шкірно-фокусна відстань - 60 см,
фільтри – 1 мм Сu + 1мм Аl, потужність дози - 38,6 р/хв.
2.2 Умови трансплантації мієлоїдних та лімфоїдних клітин опроміненим тваринам
Трансплантацію кістковомозкових клітин опроміненим тваринам проводили у
сингенній системі у кількості 5?106 клітин на мишу. Клітини уводили
внутрішньовенно через 6 годин після опромінення. Донорами і реципієнтами були
миші лінії (CBA?C57BL)F1 6-10 тижневого віку, вагою 20-22 г.
При вивченні впливу сумісного уведення кістковомозкових клітин з тимоцитами на
відновлення кісткового мозку у летально опромінених тварин реципієнтами і
донорами були миші (CBA?C57BL)F1. Клітини кісткового мозку трансплантували у
кількості 5?106 клітин на мишу, тимоцити - 20?106 клітин на мишу. Уведення
клітин здійснювалося в одному шприці (внутрішньовенно) через 6 годин після
опромінення.
Групи тварин були такі: 1) опромінення + трансплантація мієлокаріоцитів (група
порівняння); 2) опромінення + трансплантація мієлокаріоцитів сумісно з
тимоцитами (дослідна група). Контрольною групою слугували інтактні тварини
такої ж лінії, віку і ваги, як у першій і другій групах.
Методи досліджень
2.3.1 Виділення клітин кісткового мозку та лімфоїдних органів.
Клітини кісткового мозку виділяли шляхом вимивання із стегнових кісток розчином
“Гемодез” за допомогою шприца (5 мл) з голкою №25.
Тимоцити отримували, використовуючи середовище Ігла, що містило 20%
ембріональної телячої сироватки, шляхом м’якої гомогенізації органу з наступною
фільтрацією через капроновий фільтр. Перед введенням клітини двократно
відмивали центрифугуванням 1000 об/хв на протязі 10 хв, після чого
ресуспендували у свіжому розчині “Гемодез”.
Таким же чином, як тимоцити, були отримані спленоцити для вивчення супресорної
активності лімфоцитів кісткового мозку реципієнтів лімфомієлотрансплантату.
2.3.2 Підраховування клітин.
Для підрахунку клітин загальноприйнятим методом [193] використовували
гемоцитометр (камеру Горяєва). Для підрахунку ядровміщуючих клітин
застосовували 2%-ий розчин оцтової кислоти.
Краплину клітинної суспензії вносили в одну з двох половин камери, повністю
заповнюючи простір між дном камери і покровним склом. Під мікроскопом з
об’єктивом ґ10 або ґ40 підраховували кількість клітин в усіх 25 великих
квадратах камери. Одержане число помножували на 104, отримуючи число клітин, що
містяться в 1 мл суспензії, внесеній у камеру. Цю величину помножували на
фактор розбавлення вихідної суспензії.
2.3.3 Визначення абсолютного числа ядерних клітин у кістковому мозку
здійснювали у суспензії мієлокаріоцитів, отриманих з одного стегна,
загальноприйнятим методом підрахунку у камері Горяєва.
2.3.4 Цитологічне вивчення клітин.
Вивчення морфології клітин, мієлограм та лейкограм крові проводили у мазках,
виготовлених із суспензій клітин та пофарбованих азур-II-еозином по
Романовському загальноприйнятим гематологічним методом. У кожному мазку вивчали
300 клітин.
2.3.5 Визначення гемоглобіну у клітинах крові.
Гемоглобін визначали уніфікованим гемоглобінцианідним методом [194].
2.3.6 Визначення колонієутворюючих одиниць (КУОс) у кістковому мозку.
Число КУОс визначали по Till, McCulloch, 1961 [195]. Клітини кісткового мозку,
отримані із стегнових кісток експериментальних тварин на 10-90 добу після їх
опромінення і трансплантації, вводили внутрішньовенно іншим опроміненим 9 Гр
сингенним мишам-реципієнтам у дозі 1?105 клітин/мишу, що призводило до
формування окремих макроскопічно виявляємих колоній (КУОс) на їх селезінках.
Макроскопічні колонії підраховували на 8-му добу після переносу клітин у
видобутих селезінках, зафіксованих у розчині Буена.
2.3.7 Вивчення напряму диференціювання КУО.
Напрям диференціювання КУО вивчався на гістологічних препаратах, приготованих з
селезінок тварин, на яких визначали кількість КУОс методом [195].
2.3.8 Вивчення колонієутворюючої здатності клітин кісткового мозку проводили на
клітинній культурі in vitro [196, 197].
2.3.9 Вивчення проліферативної активності кровотворних клітин.
Проліферативну активність кровотворних клітин кісткового мозку реципієнтів
мієлокаріоцитів та мієлокаріоцитів у сукупності з тимоцитами вивчали методом
“тимідинового самовбивства” [198]. На 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 добу після
опромінення із стегнових кісток тварин-реципієнтів отримували клітини
кісткового мозку, які інкубували при Т=37оС протягом 30 хвилин у живильному
середовищі 199 з 3Н-тимідином (7,4 мБк/мл суспензії з питомою активністю
тимідину 18?105 мБк/ммоль). Оброблені таким чином клітини кісткового мозку
уводили іншим опроміненим реципієнтам. На 9-ту добу у селезінці цих тварин
визначали число екзоколоній. Відносну кількість клітин, що знаходяться у S-
фазі клітинного циклу, визначали за формулою:
число колоній, сформованих інтактними клітинами – число колоній, сформованих
3Н-тимідин-обробленими клітинами
КУО (у S-фазі) = ѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕѕ ? 100, %
число колоній, сформованих
інтактними клітинами
2.3.10 Вивчення продукції лімфоцитів у кровотворному органі [199].
Для помічення фракції знову сформованих лімфоцитів мишам одноразово уводили 37
кБк/г ваги тіла 3Н-тимідину у фізіологічному розчині і через 24 години від них
отримували суспензію клітин кісткового мозку.
Із суспензії готували мазки на желатин-вкритому склі для авто
- Київ+380960830922