РАЗДЕЛ 2
ОСНОВЫ ЯМР – СПЕКТРОСКОПИИ
2.1. Физические основы одномерной и двумерной ЯМР спектроскопии
Одним из наиболее эффективных экспериментальных биофизических методов
исследования биомолекул в растворе, их равновесных состояний и происходящих в
них релаксационных и обменных процессов является ЯМР спектроскопия. Метод ЯМР
позволяет получить информацию о пространственной организации и динамических
особенностях структуры биологически важных молекул в условиях, близких к
физиологическим, на атомном уровне. Это обусловило широкое применение ЯМР
спектроскопии в биофизических исследованиях и в клинической практике
[132-134].
ЯМР спектроскопия – это область спектроскопии, основанная на свойстве атомных
ядер ориентироваться в сильном магнитном поле, поглощая электромагнитное
излучение характерных частот.
Явление ядерного магнитного резонанса обусловлено наличием у ядер магнитных
моментов
m = g I, (2.1)
где g - гиромагнитное соотношение для данного типа ядер,
I - ядерный спин –вектор.
Энергий взаимодействия магнитного момента частицы m с магнитным полем индукции
В0 равна
E = g mI B0 ћ (2.2)
В соответствии с квантово-механическим правилом отбора DmI = ±1, выражение для
изменения энергии при переходе будет иметь вид:
DE = g ћ B0 , (2.3)
где DE - разность энергий верхнего и нижнего уровней.
При наложении электромагнитного поля частоты н (DE=hn) получаем условие
резонанса для любого ЯМР эксперимента:
n = (2.4)
Из (2.4) следует, что для получения ЯМР спектра поглощения образца можно
варьировать либо величину поля, либо частоту в виду прямой пропорциональности
между н и B0.
С точки зрения классической физики магнитные моменты ядер вращаются вокруг оси,
совпадающей с направлением вектора B0 с ларморовой частотой вращения,
являющейся частотой ЯМР поглощения w=2pn. Вращение может быть по часовой или
против часовой стрелки в зависимости от знака g, но оно одинаковое для любых
одинаковых ядер.
На практике наиболее широкое применение получили методики импульсной
ЯМР-спектроскопии, в которых на исследуемый образец, находящийся в стационарном
магнитном поле В0, подаются радиочастотные импульсы определенных длительностей
и последовательностей. Рассмотрим поведение ядер (например, протонов) со
спиновым квантовым числом, равным Ѕ. Пусть вектор индукции магнитного поля B0
направлен вдоль оси z, тогда в соответствии с (2.2) возможны 2 ориентации
z-компонент магнитных моментов протонов по отношению к направлению внешнего
поля: параллельная (при mI=1/2) и антипараллельная (при mI=-1/2). При этом
направление результирующей намагниченности образца M0 в силу большей
заселенности нижнего уровня будет совпадать с положительным направлением оси z
(рис 2.1).
Чтобы привести вектор M0 в движение в стандартном одномерном ЯМР-эксперименте
[135] к системе спинов прикладывают 90°-ный импульс В1, направленный вдоль оси
C, создающий поперечную намагниченность, совпадающей по направлению с осью U
(рис. 2.2).
Рис. 2.1. Ориентация магнитных моментов ядер с I=1/2 во внешнем магнитном поле
с индукцией B0 (|М’z|<|Мz|).
Рис. 2.2. а), б)– возникновение поперечной намагниченности при включении
РЧ-поля, приложенного вдоль оси x; в) – усреднение поперечной намагниченности
за счет спин-спиновой релаксации.
По окончании действия импульса поперечная намагниченность будет прецессировать
вокруг оси z, которая создаст в катушках детектора сигнал S(t), называемый
сигналом спада свободной индукции (ССИ). После преобразования Фурье функции
S(t) получают частотный спектр S(w) (рис.2.3 а,б).
Рис. 2.3. а) импульсная последовательность; б) частотный спектр S(w).
Резонансная частота ядер н, входящих в состав молекул, будет отличаться от
частоты свободного ядра вследствие экранирования электронными оболочками и
влияния химического окружения. Следовательно, частота н ядра зависит от его
положения в молекуле. Поэтому резонансное магнитное поле в (2.4) должно быть
заменено эффективным полем, учитывающим влияние окружения:
Bэфф = B0 – B’
Локальное магнитное поле B’ пропорционально B0 и обычно в 105 – 106 раз меньше.
Таким образом, поле в ядре равно:
Bэфф = B0-B' = B0(1-s), (2.5)
где s - коэффициент пропорциональности между B0 и B’, называемый константой
экранирования. С учетом (2.5) условие резонанса (2.6) запишется в следующем
виде:
n = (2.6)
В общем случае константа экранирования s определяется следующими физическими
явлениями:
локальным диамагнитным экранированием;
локальным парамагнитным экранированием;
экранированием от других источников (водородные связи, влияние растворителя,
соседние ядра, неспаренные электроны, и т.д.).
Первые два представляют собой вклады от электронов, находящихся в
непосредственной близости к ядру, то есть, от электронов, движущихся вокруг
ядра. Третье слагаемое введено для учета диамагнитного или парамагнитного
действия электронов, циркулирующих вокруг других (соседних) ядер. Этот источник
ядерного экранирования/дезэкранирования часто рассматривают как магнитную
анизотропию соседних групп.
При диамагнитном экранировании имеет место ослабление внешнего магнитного поля
В0, приложенного к исследуемому образцу, локальным магнитным полем Вў, что
приводит к сдвигу резонансного сигнала в область более низких частот.
Парамагнитное экранирование возникает при совпадении направлений локального Вў
и внешнего В0 магнитного полей, что пр