РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкт дослідження.
Об’єктом дослідження були 66 штамів, вилучених з кишечника здорових дітей, 7
штамів, вилучених з кишечника хворих на дисбактеріоз дітей, що мешкають в
Одеському регіоні, та 4 музейних штами: L. bucheri АТСС 4005, L. fermentum ATCC
14931, L. acidophilus АТСС 33200 і L. acidophilus АТСС 4356.
2.2. Вилучення штамів та отримання чистих культур
Штами виділяли з фекалій дітей віком від 1 до 7 років. Для забору біоматеріалу
використовували ватні тампони, накручені на дерев’яні палички. Транспортним
середовищем слугувало знежирене натуральне молоко [97]. Накопичувальні культури
отримували шляхом триразового пересівання в MRS-бульон, посіви інкубували
протягом 24 годин при 37 °С. Чисті культури отримували шляхом наступного висіву
накопичувальних культур на тверде живильне середовище MRS за методом Коха.
Культивування та зберігання чистих культур провадили на рідкому та тужавому
середовищі MRS [131].
2.3. Встановлення родової приналежності
Для встановлення приналежності вилучених штамів бактерій до роду Lactobacillus
використовували стандартні методики [86].
Морфологія клітин
Морфологію клітин вивчали через 24 – 48 годин культивування мікроорганізмів у
рідких та на твердих живильних середовищах за допомогою світлопольного
мікроскопу “Біолам – 4” при збільшенні 1350x. Вивчали форму, розміри клітин,
тенденцію до утворення ланцюжків та здатність до забарвлення за методом Грама.
Рухливість
Рухливість визначали мікроскопічним методом у вологих препаратах, приготованих
з бульйонних культур.
Характеристики колоній
Форму, колір, розмір, консистенцію, прозорість тощо виявляли на твердому
живильному середовищі MRS через 1 добу.
Ставлення до температури
Ставлення до температури визначали за наявністю росту мікроорганізмів при 15 ?С
та 45 ?С через 1 – 3 доби культивування.
Аеробність/анаеробність
Аеробність/анаеробність перевіряли у пробірках з високим стовпчиком агарового
середовища через 3 – 7 діб після інокуляції.
Утворення газу з глюкози
Здатність утворювати газ з глюкози визначали в агаровому середовищі, покритому
голодним агаром та вазеліновим маслом
Кислотоутворення з вуглеводів
Здатність утворювати кислоту з вуглеводів визначали в напіврідкому живильному
середовищі за зміною кольору індикатора (1,6 %-вого бромкрезолпурпуру, доданого
до середовища з розрахунку 1 мл/л) з фіолетового на жовтий.
Тест на каталазу
Каталазну активність виявляли по утворенню пухирців газу після обробки колоній
3 %-вим розчином перекису водню.
Тест на оксидазу
Наявність оксидази визначали, наносячи біомасу на смужку спеціалізованого
індикаторного паперу.
Гідроліз желатину
Здатність до гідролізу желатину вивчали, інокулюючи культури бактерій в
бульйон, що містив 12 % желатину.
Здатність до спороутворення
Здатність до спороутворення визначали мікроскопічним методом, вивчаючи культури
різного віку.
Родову приналежність вилучених чистих культур провадили за Визначником бактерій
Бергі [159].
2.4. Методи вивчення біологічної активності лактобацил in vitro
Здатність до адгезії
Адгезивність штамів лактобацил вивчали на моделі “еритроцит – лактобацила”.
Таку модель було випробувано на 4000 штамів ентеробактерій, стафілококів,
стрептококів тощо. Можливість застосування цього методу було доведено в
порівняльних дослідженнях з використанням тканинної культури Нер-2, а також
епітеліальних тканин слизових оболонок щічної області та піхви [11].
Лактобацили вирощували протягом 24 годин при 37 °С в рідкому живильному
середовищі MRS. Еритроцити людини О (І) групи тричі відмивали фосфатним буфером
з рН 7,2 – 7,4, рахували в камері Горяєва та готували суспензію еритроцитів у
концентрації 108 кл/мл.
Схема дослідження адгезивності лактобацил включала два методи – експресний і
розгорнутий [13]. Для постановки експресного методу дослідження адгезивних
властивостей лактобацил на предметні скельця наносили одну краплю (посівну
петлю) буферного розчину, в якому поєднували по одній краплі суспензій
еритроцитів і мікроорганізмів, узятих з живильного середовища. Предметні
скельця поміщали до вологої камери на 30 хвилин при 37 °С, потім висушували при
тій же температурі. Препарати фіксували жаром і фарбували за методом Грама,
після чого проводили їх мікроскопічне дослідження при збільшенні 1350x.
Рахували кількість клітин лактобацил, які прикріпилися до 1 еритроцита при
підрахунку не менше 25-ти еритроцитів, враховуючи не більше 5-ти еритроцитів в
одному полі зору. Здатність клітин лактобацил до адгезії оцінювали за допомогою
середнього показника адгезії (СПА). Адгезивність вважали нульовою при СПА від 0
до 1,0, низькою – від 1,01 до 2,0, середньою – від 2,01 до 4,0, високою – вище
за 4,0 клітин, що прикріпилися до одного еритроцита.
Для постановки розгорнутого методу дослідження адгезивних властивостей чисті
культури штамів лактобацил, вирощені упродовж 24 годин при 37 °С у рідкому
живильному середовищі MRS, центрифугували при 3000 об/хв протягом 30 хв і тричі
відмивали фосфатним буфером рН 7,2 – 7,4, після чого концентрацію бактеріальної
суспензії доводили до 109 кл/мл. У дослідних пробірках поєднували по 0,5 мл
суспензій еритроцитів та лактобацил, інкубували при 37 °С протягом 30 хвилин
при періодичному струшуванні, після чого на знежирених предметних скельцях
готували мазки і мікроскопіювали їх, як вказано вище.
Здатність до гемаглютинації
Здатність до гемаглютинації вивчали на моделі “еритроцит-лактобацила” за
допомогою реакції гемаглютинації (РГА) [12]. У імунологічних планшетах
поєднували по 0,02 мл суспензій лактобацил на фосфатному буфері з рН 7,2 – 7,4,
отриманих, як описано вище, та еритроцитів у тому ж буфері в концентрації 108
кл
- Київ+380960830922