Розділ 2
Матеріали і методи
2.1. Методичні підходи
Для вивчення впливу різних хімічних речовин на ультраструктуру клітин
пучково-сітчастої зони кори надниркових залоз щура та концентрацію вільних
іонів кальцію в цитоплазмі цих клітин ми використовували такі методичні
підходи.
• Виділення ізольованих клітин кори надниркових залоз щура.
• Приготування культури клітин кори надниркових залоз щура.
• Фіксації клітин, вміщення клітин в аралдит, контрастування та приготування
ультратонких зрізів.
• Вивчення ультраструктури клітин за допомогою електронного мікроскопу.
• Флюорометричне дослідження концентрації вільних іонів кальцію в цитоплазмі
клітини
2.2. Приготування культури клітин кори надниркових залоз щура
2.2.1. Виділення клітин кори надниркових залоз
Експерименти проводили на білих нелінійнійних щурах масою 180-230 грамів, що
утримувались на стандартному харчовому раціоні, та звичайному температурному
режимі в віварії Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Вибір
віку визначався повною фізіологічною зрілістю тварин та у зв’язку із цим
величиною та сформованістю надниркових залоз. У дорослої тварини його розміри
складають 3х5х2мм. Для отримання свіжоізольованих клітин використовувалась
стандартна процедура ферментативної ізоляції раніше описана (182). Щура
анестезували за допомогою ефіру у спеціальному ексикаторі. Через 10-12 хвилин,
коли тварина знаходилась у стадії глибокого сну, її декапітували і проводили
операцію по виділенню надниркових залоз. Для цього розкривали черевну порожнину
і обережно видаляли обидві надниркові залози, що розташовуються в сполучній
тканині трохи вище нирок. Виділені надниркові залози поміщали у розчин №1
(NaCl-155мМ, Hepes-10мМ, Глюкоза-10мМ, KCl-6мМ рН 7.4), в який також додавався
антибіотик гентоміцин (40мкл/10мл). Після цього для видалення кров’яних тілець,
що залишилась в тканині, надниркові залози промивали за допомогою тонкої голки
тим самим розчином, але вже без антибіотика. Ферментативну обробку тканини
проводили в розчині №1, в який також додавалось 2.5 мг/мл колагенази типу А
(Sigma, США) та 0.5% альбумін сироватки крові бика (BSA) (Sigma, США); для
підсилення гідролізу глибоких шарів кори перед початком ферментативної обробки
додаткова порція цього ж розчину вводилась в середину надниркової залози, через
вену. В ферментативному розчині тканини витримували протягом 25 хвилин при
температурі +37оС. Після цього, надниркові залози розрізали навпіл і за
допомогою стерильного скальпеля видаляли більш темний за кольором мозковий шар.
Далі фермент видалялили із тканини, 5 разів повністю змінюючи розчин у
пробірці. Відмиту тканину пропускали крізь стерильне нейлонове сито із
діаметром пори 100мкм. Отриманий після цього гомогенат центрифугували протягом
6-7 хвилин при швидкості 1000 обертів на хвилину. Надосадову рідину зливали, а
об’єм осаду доводили до 1 мл розчином №1. Окремі клітини отримували за
допомогою м’якого, повільного піпетування із використанням піпеток різного
диаметру. Отвір кінчика складав біля 1 мм. Після цього клітини поміщали на
покриті поліорнітином (Sigma) акларові пластинки (Nunc Inc. USA).
2.2.2. Умови культивування клітин
Через п’ятнадцять хвилин клітини закріплювались на акларових пластинках. Далі
їх переносили до чашки Петрі, що містила 2мл розчину №2 (Dolbecco’s Мodified
Еagles medium (DME), без соди-13.4г/л, NaHCO3-2.2г/л, HEPES-2.38г/л,
пеніцілін/стрептоміцин-5мл/л, гентаміцин-2мл/л, кінську сироватку крові-100мл/л
). Після цього чашки Петрі поміщали в СО2-інкубатор (Ули-20, Россія). Кількість
СО2 в камері інкубатора підтримувались на рівні 5%, а вологість 95%. Інкубація
проводилась при +37оС. За таких умов рН в навколоклітинному розчині дорівнював
7.4.
2.4. Інкубація із досліджуваними речовинами
2.3.1. Інкубація клітин із АКТГ
У нашому експерименті ми використали біологічно активний фрагмент молекули
АКТГ, що містив в собі 4-10 амінокислотні залишки нативної молекули (SERVA).
Відомо, що нативна молекула АКТГ, яка синтезується в аденогіпофізі, звичайно
містить 39 амінокислотних залишків, але тільки перші 24 залишки безпосередньо
зв’язуються із гормон-рецепторним комплексом, а інші потрібні для переносу
молекули гормону із кров’ю (138). Разом із тим, і менші за розмірами фрагменти
АКТГ також мають стероїдогенну активність. Зокрема фрагмент АКТГ, що
утворюється 4-10 амінокислотними залишками нативної молекули, зберігає
стероїдогенну, меланоцитстимулюючу та ліполітичну активності, що властиві для
нативної молекули (138), але при цьому спостерігається послаблення активності,
що вимагає підвищення ефективної концентрації при використанні цього фрагменту.
Так, найменшими фрагментами молекули АКТГ, що можуть відтворювати увесь спектр
біологічної активності нативної молекули є саме фрагменти АКТГ 4-10 або АКТГ
5-10 (138). Разом із тим за даними (139), насичуючою концентрацією, що викликає
максимальний стероїдогенний ефект для нативної молекули АКТГ є 3.4*10-3 мкМ,
такий самий, за інтенсивністю ефект викликає аплікація фрагменту АКТГ 5-10 у
концентрації 10 мкМ (Serva). Отже в наших експериментах ми використовували саме
цю насичуючу концентрацію.
Експеримент проводився таким чином: акларові пластинки із клітинами занурювали
у розчин №3 (NaCl-150мМ, Hepes-10мМ, CaCl2-2мМ ,MgCl2-2мМ, KCl-5мМ рН 7.4) що
також містив АКТГ у концентрації 10 мкМ. Через 10 хвилин клітини фіксували і
підготовляли для електронно-мікроскопічних досліджень.
2.3.5. Інкубація клітин із іонофором А23187
Кальцієвий іонофор А23187 широко використовується в біологічних дослідженнях
для збільшення концентрації іонів кальцію в цитоплазмі клітини (141, 142). Під
час нашого д
- Київ+380960830922