Ви є тут

Структурно-фунціональна організація клітин епідерми однорічних пагонів жовтої акації Caragana arborescens Lam.

Автор: 
Чернишов Дмитро Петрович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2005
Артикул:
0405U001968
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
2. Об'єкт та методи дослідження
2.1. Об'єкт
Об’єктом дослідження було обрано епідерму черешків листків, квітконіжок та
чашолистків однорічних пагонів жовтої акації Caragana arborescens Lam. (род.
Fabaceae) (рис. 2.1.1 та 2.1.2).
Рис. 2.1.1 Фрагмент куща жовтої акації під час цвітіння
Рис. 2.1.2 Фрагмент гілки жовтої акації під час цвітіння
Жовта акація відноситься до групи чагарників з прискореним циклом весняного
розвитку; від розпускання бруньок до закінчення цвітіння проходить 10-15 днів,
в залежності від температури навколишнього середовища. Ця особливість
онтогенезу дає можливість вивчати процес диференціювання епідермальних клітин
листків, квітконіжок та чашолистків майже одночасно. Крім того, цей об’єкт був
обраний ще й тому, що ще в середині двадцятого сторіччя в клітинах епідермісу
було описано наявність специфічних тілець, які розглядалися в ті часи як
новоутворені ядра, але пізніше було доведено, що вони не містять ДНК, звичайно
не є ядрами [12, 160], але їх структура та природа залишалися нез’ясованими.
Дослідження проводили, починаючи від початку розпускання бруньок до опадання
пелюсток на наступних послідовних фазах онтогенезу рослин: розпускання бруньок
(протодермальні клітини); початок бутонізації (розтягання клітин); цвітіння та
утворення зав’язей (диференційовані клітини). З черешків, квітконіжок або
чашолистків здирали смужки епідермісу, які використовували для подальших
досліджень.
Матеріал збирали в парках міст Києва та Донецька (Україна), Гомеля (Білорусь)
та Санкт-Петербурга (Росія) від початку до кінця травня. Від листопада до
березня використовували зрізані гілки жовтої акації, які ставили на вигонку у
живильний розчин Кнопа [258] та одержували розпускання бруньок та цвітіння
квітів.
2.2. Методи дослідження
Для досліджень використовували методи світлової мікроскопії, флуоресцентної
мікроскопії, електронної мікроскопії, світлової цитохімії, електронної
цитохімії, визначення спектру сумарних білків та вірусологічні методи.
Дослідження проводили на живому та фіксованому матеріалі. Смужки епідермісу
фіксували 10% формаліном, у суміші Карнуа, 2,5% розчином глутарового альдегіду
[259]. Для візуалізації внутрішньоклітинних тілець смужки епідерми забарвлювали
водним розчином Люголю.
Структура епідермальних клітин
Поверхню епідермальних клітин було вивчено методом скануючої електронної
мікроскопії після фіксації матеріалу у 2,5% розчині глутаральдегіду на 0,1 М
Na-фосфатному буфері рН 7,2 , пост фіксації в 1% розчині OsO4 та проведенні
зразків крізь зростаючі концентрації спиртів. Після цього висушували матеріал
за допомогою критичної точки та досліджували за допомогою скануючого
електронного мікроскопа JSM 35 (Jeol, Японія).
Поверхню епідермальних клітин було вивчено також методом конфокальної
мікроскопії після фіксації матеріалу у 70% етиловому спирті. Матеріал
досліджували за допомогою конфокального лазерного мікроскопу LSM 5 Pascal (Carl
Zeiss, Німеччина).
Ультраструктура епідермальних клітин
Для вивчення ультраструктурної організації клітин матеріал фіксували в 2,5%
розчині глутаральдегіду на 0,1 М Na-какоділатному буфері рН 7,2, постфіксували
в 1% розчині OsO4 на 0,1М Na-какоділатному буфері рН 7,2 та зневоднювали шляхом
проведення матеріалу крізь зростаючі концентрації етанолу та ацетону. Матеріал
полімерізували у суміші епоксидних смол [259].
Ультратонкі зрізи об’єктів (30-50 нм) робили за допомогою скляних ножів на
ультрамікротомі LKB 8800 (Швеція). Одержані зрізи наносили на бленди з
формваровою плівкою та досліджували за допомогою трансмісійного електронного
мікроскопа JEM 1200 EX (Jeol, Японія).
Цитохімія епідермальних клітин
Світлова мікроскопія
Для визначення ДНК проводили реакцію Фьольгена за стандартною методикою, а
також забарвлення 0,125% водним розчином азура В (2 години при 450С) [260].
Для визначення РНК застосовували обробку сумішшю розчинів метилового зеленого
та піроніну за Унна [260].
Присутність білків у внутрішньоклітинних тільцях виявляли фарбуванням матеріалу
сумішшю 1% розчина HgCl2 та 0,1% розчина бромфенолового синього на 2% водному
розчині оцтової кислоти, а також 0,1% водним розчином міцного зеленого [260].
Присутність аргентофільних білків у внутрішньоклітинних тільцях на рівні
світлової мікроскопії виявляли імпрегнацією матеріалу 2% водним розчином AgNo3
при 700С протягом 4-15 год., в темноті [259].
Присутність ліпідів та полісахаридів (крохмалю) у внутрішньоклітинних тільцях
виявляли фарбуванням за звичайними методиками [260].
Препарати досліджували за допомогою світлового мікроскопу Axioskop (Carl Zeiss,
Німеччина).
Електронна мікроскопія
Для виявлення присутності аргентофільних білків у внутрішньоклітинних тільцях
на рівні електронної мікроскопії, матеріал імпрегнували 2% водним розчином
AgNO3 2 години при 600С, обробляли сумішшю 10% формола та 1% гідрохінону в
співвідношенні 1:1, зневоднювали в зростаючих концентраціях етилових спиртів,
проводили через суміш абсолютного етанолу та абсолютного ацетону та заключали в
суміші епоксидних смол [259]. Ультратонкі зрізи наносили на бленди з
формваровою плівкою та аналізували за допомогою трансмісійного електронного
мікроскопу JEM 1200 EX (Jeol, Японія).
Обробка ферментами на рівні електронної мікроскопії
Наявність білків у внутрішньоклітинних тільцях на рівні електронної мікроскопії
ультратонкі зрізи (30-50 нм) матеріалу обробляли 1% розчином пронази (Sigma,
США) на деонізованій воді рН 7,2 протягом 30 хвилин, контрастували цитратом
свинцю [259] та аналізували за допомогою трансмісійного електронного мікроскопу
JEM 1200 EX (Jeol, Японія).
Флуоресцентна мікроскопія
Для визначення Д