РОЗДІЛ 2.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Виділення фракції синаптосом з головного мозку щурів
Дослідження виконані на лабораторних щурах (самці вагою 100-120 г). Тварини
були вбиті шляхом декапітації і у них швидко вилучено головний мозок. Для
експериментів брали великі півкулі, відокремлюючи стовбурову частину та
мозочок.
Синаптосоми виділяли з гомогенату великих півкуль мозку щурів за методом
Котмана [59]. 20% гомогенат готували у скляному гомогенізаторі Поттера (зазор
0.2 мм) у середовищі виділення, яке містило 0.32 М сахарози, 5 мM HEPES-NaOH
(pH 7.4) i 0.2 мM EДTA. Гомогенат розводили середовищем виділення до 10%.
Гомогенат центрифугували при 2 500 g протягом 5 хв для відокремлення ядер,
кровоносних судин, зруйнованих нервових клітин. Подальше центрифугування
надосадової рідини при 12 000 g протягом 10 хв дозволяло одержати грубу
фракцію –мітохондрії, синаптосоми, мієлінізовані залишки. Отриманий осад
ресуспендували в середовищі виділення та наносили на градієнт фіколлу (13%, 6%
та 4%). Розчин сахарози для градієнта фіколлу містив 5 мM HEPES-NaOH (pH 7.4) i
0.2мM EДTA. (це незначна модифікація методу Котмана). Центрифугували при 70
000g протягом 45 хв на бакет-роторі. Основна маса фракції синаптосом
зосереджується в інтерфазі між 13% та 6% розчинами. Її збирали, розводили
середовищем виділення у співвідношенні 1:4 та центрифугували при 15 000 g 20
хв. Отриманий осад представляв собою синаптосоми, відмиті від фіколлу.
Фракцію синаптосом суспендували в охолодженому стандартному сольовому розчині,
що містив (мM): NaCl – 126, KCl – 5, MgCl2 – 1.4, NaH2PO4 – 1.0, HEPES – 20 (pH
7.4), d-глюкозу – 10, амінооксиоцтову кислоту – 0.1. Кальційвмісне середовище
мало 2 мM СаCl2. Безкальцієве середовище містило 1мM ЕГТА та не містило
доданого кальцію. Сольовий розчин насичувався киснем перед використанням. Усі
операції проводили на льоду (при 0-4оС).
Кінцева концентрація білку становила близько 3 мг/мл. Загальний вихід складав
12-15 мг білка синаптосом на 1 г вологої ваги мозку. Концентрацію білка
визначали за методом Лоурі [157] у модифікації Ларсона [149].
Синаптосоми розводили стандартним сольовим розчином до концентрації 2 мг
білка/мл та після інкубації 10 хв при 37оС навантажували протягом 10 хв 50нМ
[3H]ГАМК (2мКі/мл) у стандартному сольовому розчині, що містив 1 мМ кальцію.
Для запобігання утворення метаболітів ГАМК в усіх експериментах у середовище
була додана 100мкM амінооксиоцтова кислота (інгібітор ГАМК-трансамінази). Після
навантаження суспензію синаптосом охолоджували на льоду, розводили у 10 об’ємах
стандартного сольового розчину та центрифугували 5 хв при 4 500 g. В осаді
одержували синаптосоми, відмиті від [3H]ГАМК, яка не захопилася, та від
кальцію. Синаптосоми суспендували в номінально безкальцієвому стандартному
сольовому розчині, доводячи концентрацію білку до 1мг/мл. Препарат
використовувався для досліджень одразу і не довше 4 год після виділення.
Визначення кількості вивільненої із синаптосом [3H]ГАМК
Безпосередньо для досліду в кожній пробі суспензію синаптосом розводили в 5
разів у стандартному сольовому розчині, що містив кальцій (кінцева концентрація
2мM) чи не містив кальцію, а містив EГTA (кінцева концентрація 1мM).
Кількість вивільненої із синаптосом [3Н]ГАМК визначали в такий спосіб.
Безпосередньо перед додаванням стимулюючих агентів аліквоти 120 мкл (25-30 мкг
білку навантажених синаптосом) центрифугували протягом 20 сек при 10 000 g.
Кількість [3H]ГАМК визначали в супернатантах і в SDS-розчинених осадах шляхом
вимірювання радіоактивності у сцинтиляційній рідині AСS на лічильнику Delta 300
(“Tracor Analytic”, США).
Цей початковий рівень міченої ГАМК приймався за нульову точку. Вміст [3H]ГАМК у
супернатантах був виражений у відсотках від загальної кількості мітки у
синаптосомах.
Вивільнення [3H]ГАМК із синаптосом, преінкубованих без стимулювальних агентів в
Ca2+-вмісному або безкальцієвому середовищі, приймалося за базальне
вивільнення.
Вивільнення [3H]ГАМК стимулювали додаванням 4-амінопіридину (2мM, кінцева
концентрація), KCl (25 або 50 мM, кінцеві концентрації) або б-латротоксину (0.5
– 3 нM, кінцеві концентрації). Після певних проміжків часу 120 мкл аліквоти
центрифугували, і визначали кількість [3H]ГАМК за вищезазначеним методом.
Стимульоване вивільнення [3H]ГАМК обчислювали як різницю між кількістю
[3H]ГАМК, що вивільняється під впливом стимулювальних агентів, і базальним
вивільненням.
Детальніше умови експериментів подані у підписах до відповідних рисунків.
Визначення величини мембраного потенціалу синаптосом
Зміни трансмембранного потенціалу синаптосом реєстрували за допомогою
катіонного потенціалчутливого зонду родаміну 6G (Rh 6G) [8]. Виміри
флуоресценції проводили на спектрофлуориметрі Hitachi MPF-4 (Японія) у
термостатованій кюветі при постійному перемішуванні. Довжини хвиль збудження і
флуоресценції були 528 нм і 551 нм, відповідно (ширина щілин – 5 нм).
Концентрація зонда в пробі дорівнювала 0.5 мкМ, а концентрація білка в
синаптосомальній суспензії становила 0.15 мг/мл. Стаціонарний рівень
флуоресценції Rh 6G досягався через 3-5 хв після його внесення в суспензію
синаптосом. Зміну мембраного потенціалу оцінювали за допомогою індексу
мембранного потенціалу (F), який розраховували за формулою
F = Ft / F0,
де F0 і Ft – інтенсивності флуоресценції Rh-6G у відсутності та у присутності
синаптосом.
F0 обчислювали шляхом екстраполяції функції експоненційного загасання
флуоресценції до вихідного значення в нульовий момент часу. Стаціонарний рівень
флуоресценції зонду Ft визначався до або пі
- Київ+380960830922