РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Под наблюдением находилось 158 беременных, из них 40 больных с отеками во время беременности, 39 с легкой степенью ПБ, 14 со средней степенью преэклампсии и 9 беременных с тяжелым течением гестоза; 56 здоровых беременных составили группу контроля. Для определения нормативных показателей были обследованы 10 здоровых небеременных женщин.
Во всех группах обследуемых изучался анамнез жизни, акушерский и соматический анамнезы, становление и характер менструальной и детородной функций. Исследования проводились в сроке гестации 30-41 недель, возраст беременных составил от 16 лет до 41 года. Кроме общего и акушерского осмотров, всем беременным проводились общепринятые клинико-лабораторные методы обследования: коагулограммы, определение общего белка, содержания глюкозы в сыворотке крови, ионограммы, уровня креатинина и мочевины. Степень тяжести преэклампсии оценивалась по модифицированной шкале Г.М. Савельевой (1989), где кроме основных симптомов ПБ учитывалась длительность заболевания, наличие экстрагенитальной патологии, гипотрофии плода. Кроме того, всем беременным проводились пробы на прегестоз.
В качестве материала исследования использовалась сыворотка крови беременных женщин. Кровь для исследования брали из локтевой вены.
2.1. Определение перекисного окисления белков.
Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. В настоящее время некоторыми авторами высказано предположение, что возможной причиной выраженной деструкции белков при ПБ является активизация АФК, усиливающая процессы перекисного окисления белков, липидов, нуклеиновых кислот, ферментов [62,63,65]. В тканях, подвергшихся ишемии, что имеет место при преэклампсии из-за генерализованного вазоспазма, активно проходят процессы генерации активных форм кислорода, которые, в первую очередь, индуцируют повреждение клеточных мембран и, как следствие, возникновение новых антигенов на поверхности клеток, что приводит к их взаимодействию с циркулирующими в крови иммунными комплексами. В результате этого в тканях может начаться каскад реакций, приводящих к их деструкции, несостоятельности функций органов и систем, что, в конечном итоге, приводит к полиорганной недостаточности [18,62]. В связи с выше изложенным, нами была изучена окислительная модификация белка в сыворотке крови беременных с преэклампсией различной степени тяжести.
Принцип оценки интенсивности окислительной модификации белков основан на реакции взаимодействия окислительных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидрозином (2,4-ДФГ) с образованием его производных. В результате окисления белков образуются альдегидные и кетоновые группировки аминокислотных остатков, которые взаимодействуют с 2,4-ДФГ [48,146].
Определение интенсивности ОМБ сыворотки крови человека по модифицированной методике Е.Е. Дубининой [48]. Для анализа использовали 0,05-0,1 мл сыворотки здоровых людей. Осаждение белков сыворотки крови осуществляли с помощью 20% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ). К денатурированным белкам приливали равный объем (1 мл) 0,1М 2,4-ДФГ, растворенного в 2М НСL. В контрольную пробу добавляли вместо 2,4-ДФГ равный объем 2М НСL. Инкубацию осуществляли при комнатной температуре в течение 1ч. Затем пробы центрифугировали при 3000g в течение 15-20 мин. Осадок промывали 3 раза раствором этанол-этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДФГ, который не реагировал с карбонильными группами окисленных белков. Полученный осадок подсушивали с целью устранения оставшегося растворителя этанол-этилацетат и затем растворяли в 8М растворе мочевины. Мочевину приливали к осадку в объеме 2,5 мл и выдерживали в кипящей бане в течение 5 минут до полного растворения. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидрозонов регистрировали на спектрофотометре при ?=356, 370, 430 нм. Уровень карбонильных групп при длине волны 370 нм рассчитывали, используя коэффициент молярной экстинции, равный 21000 для ДНФ-производных.
Определение карбонильных производных белков с помощью 2,4-ДФГ без и при введении системы, инициирующей окислительную деструкцию белковых молекул, позволяет оценить интенсивность этого процесса в норме и при состояниях окислительного стресса в организме.
2.2. Определение показателя средних молекул в сыворотке крови человека.
Молекулы средней массы - белковые компоненты плазмы крови с молекулярной массой от 500 до 5000 Дальтон, впервые обнаружены у больных с хронической почечной недостаточностью [36]. В настоящее время имеются данные о том, что СМП накапливаются в организме больных не только при уремии, но и при различных интоксикациях эндо- и экзогенного происхождения, в частности при преэклампсии беременных [28,45]. К эндотоксинам относятся продукты естественного обмена в высоких концентрациях, активированные ферменты, среднемолекулярные вещества различной природы, перекисные продукты, агрессивные компоненты комплемента, бактериальные токсины, а также молекулы средней массы - промежуточные продукты протеолиза, накапливающиеся в организме при угнетении естественных механизмов детоксикации и нарушении обмена веществ. Имеется прямая зависимость между степенью эндогенной интоксикации и концентрацией СМП в крови при различных формах преэклампсии. Отмечаются также изменения содержания параметров эндогенной интоксикации при ПБ - увеличивается содержание СМП в эритроцитах и снижается в плазме [45]. Повышение уровня СМП, определяемое на фоне незначительных изменений большинства традиционных показателей, позволил выделить группу риска - больных с наименее благоприятным течением заболевания, требующим активного проведения соответствующих лечебных мероприятий [36].
Определение концентрации СМП в сыворотке крови беременных по методу Н.И. Габриэлян [36]. Кровь для исследования брали из локтевой вены. Сыворотку обрабатывали 10% раствором трихлоруксусной кислоты, соотношение сыворотки и кислоты 1:0,5. Осветление достигалось центрифугированием при скорости 3000 об/мин в те