РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Методы исследования
Эндоскопическое исследование желудка и ДК осуществлялось гастрофиброскопом ХР-20 фирмы "Olympus" (Япония) с учетом показаний и противопоказаний [50]. Эндоскопический метод считали ведущим и наиболее информативным при постановке диагноза ЯБ, а также для оценки состояния слизистого барьера ГДЗ. Обязательным было проведение контрольного эндоскопического обследования для оценки эффективности проводимой терапии.
При ФЭГДС у всех больных производилась биопсия из слизистой ГДЗ для проведения гистохимических и иммуноморфологических исследований, а также для обнаружения хеликобактерной контаминации СО.
Предварительно проводили рентгенологическое исследование верхних отделов желудочно-кишечного тракта, при котором уточняли функциональное состояние пищевода, желудка и ДК, выясняли степень деформации этих органов, а также осуществляли постановку предварительного диагноза. Методика рентгенологического исследования не отличалась от общепринятой.
Кислотообразующая и кислотонейтрализующая функции желудка изучались с помощью фракционного исследования желудочного сока. В качестве стимулятора использовали гистамин в дозе 0,008 мг/кг массы тела.
Для оценки динамики кислотности вычисляли кислотную продукцию по формуле:
КП = КхV/1000,
где КП - кислотная продукция (в ммоль, 1 ммоль = 36,5 мг соляной кислоты), К - общая кислотность (в ммоль/л), V - объем желудочного секрета (в мл).
В норме БКП (базальная кислотная продукция) - 1,5-5,5 ммоль/ч;
СКП (стимулированная кислотная продукция) - 8-14 ммоль/ч.
Оценка иммунологического статуса проводилась по данным исследования Т- и В-лимфоцитов и фагоцитарной активности нейтрофилов.
Выделение лимфоцитов проводили на градиенте Фиколл-Верографина [28]. Количество Т-общих и Т-активных лимфоцитов в крови определяли при помощи реакции Е-розеткообразования [264,283]. Исследование субпопуляций Т-лимфоцитов - Т-хелперов (CD4+) и Т-супрессоров (CD8+), а также В-лимфоцитов (CD20) проводили методом мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител анти-CD4, анти-CD8 и анти-CD20 [229].
Количественное определение уровня основных классов иммуноглобулинов (А, G, М) проводили методом радиальной иммунодиффузии в геле [323].
Фагоцитарную активность нейтрофилов крови определяли с помощью классической методики опсонофагоцитарной реакции в модификации В.Н.Бермана и Е.М.Славской [32].
Уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли способом преципитации в растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 дальтон по Diogen et al. в модификации. Молекулярный состав ЦИК с выделением фракций с средне и низкомолекулярных комплексов определяли путем дифференцированной преципитации в 3,5% и 7% растворах ПЭГ.
Гистологическое и иммуноморфологическое исследование позволяло определить морфофункциональное состояние СО желудка. Для этого при ФЭГДС после визуального обследования методом щипка забирались 1-4 гастробиоптата СО привратника желудка с последующей фиксацией полученного материала в 10% растворе нейтрального формалина (по Лили) и заливкой в парафин.
Полученные гистологические срезы материала толщиной 5-7 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван Гизону. Гистохимически выявляли ДНК (реакция Фёльгена-Россенбека), РНК (реакция Браше), общий белок (реакция Даниелли)[134].
Для оценки состояния стромального комплекса в гастробиоптатах и оценки слизистого барьера ГДЗ были изучены гликозамингликаны - альциановым синим по Стидмену [126]; уровень нейтральных гликозамингликанов определяли ШИК-реакцией и по Мак-Манусу. Результаты гистохимического исследования оценивали цитофотометрически с использованием компьютерных технологий (Olympus).
Для идентификации и количественной оценки НР был применен гистологический метод исследования путем усиленной окраски гистологических препаратов биоптатов СО желудка по Романовскому-Гимзе [8].
Основной раствор: краска Гимзы-1,0; глицерин-54 мл; этиловый спирт 96%-84 мл. Рабочий раствор: основной раствор-1 мл; дистиллированная вода-38 мл; углекислый калий 0,1%-2 мл.
Окраска:
1. Депарафинированные срезы довести до дистиллированной воды и оставить на 10-15 минут.
2. Рабочий раствор - на 20 минут.
3. Промывание в дистиллированной воде, обезвоживание, просветление, заключение в канадский бальзам.
При этой окраске НР окрашиваются в темно-синий цвет и хорошо определяются как на поверхности покровного эпителия (чаще в слизи), так и в глубине ямок, в просвете желез, а также в интерцеллюлярных промежутках, при этом НР чаще всего представлен палочковидными и V-образными формами ("типа чайки"). В полученных гистологических препаратах выделяли три степени контаминации НР СО желудка [8], обозначаемые количеством плюсов (+) при увеличении микроскопа Х630:
Слабая (+) до 20 микроорганизмов в поле зрения
Средняя (++) до 50 микроорганизмов в поле зрения
Высокая (+++) более 50 микроорганизмов в поле зрения.
Биохимическое исследование гастробиоптатов для верификации НР проводили с помощью посева на среду Закса (спиртовой раствор мочевины и индикатора) с использованием методики D.Grechem, 1987. Результат реакции оценивали через 30 минут изначально и через 20 часов окончательно. Изменение окраски среды с желтого на фиолетовый цвет указывало на присутствие НР, обладающих уреазной активностью [46].
Для изучения микроциркуляторного русла в гастробиоптате желудка была применена методика окрашивания азотнокислым серебром по В.В.Куприянову (1969)[134].
Количественная морфометрическая характеристика СО желудка в гастробиоптатах оценивалась с помощью компьютерного цитоанализатора "Olympys" (Япония), окуляра микрометра АМ9-2, окулярной линейки и сетки Г.Г.Автандилова (1991), что позволило определить количественные изменения (толщина) слизи, выраженность атрофии СО, степень контаминации НР и состояние тонуса микроциркулят
- Київ+380960830922