РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Групи жінок та лікувально-профілактичні заходи
Відповідно до поставленої мети і задач нами було обстежено 150 пацієнток, серед яких 100 - з внутрішньоутробним інфікуванням, що були розділені на такі групи:
І група - 50 жінок з інтраамніальним інфікуванням, отримувавших загальноприйняті лікувально-профілактичні заходи;
ІІ група - 50 жінок с інтрамніальним інфікуванням, отримувавших запропоновану нами методику.
Контрольну групу склали 50 первородящих без акушерської і соматичної патології, розроджених своєчасно через природні пологові шляхи.
Діагноз інтраамніального інфікування встановлювали на підставі загальноприйнятого симптомокомплексу згідно остан-ніх рекомендацій літератури на підставі таких ознак: клінічні, ехографічні і мікробіологічні. До клінічних відносили наявність загострення хронічних запальних захворювань сечостатевої системи, гіпертермія неясного генезу та ін. До ехографічних - затримка внутрішньоутробного розвитку плода по асиметричному варіанту, мало- та багатоводдя і ін. До мікробіологічних - рецидив або гострі форми вірусної інфекції (ЦМВ і ВПГ), високий рівень мікробного обсіменіння статевих шляхів і ін.
Загальноприйяті лікувально-профілактичні заходи включали в себе використання за показаннями антибактеріальних препаратів; комплекси вітамінів і мікроелементів; засоби, що покращують мікроциркуляцію (курантил, трентал, компламін); імунокоригуючу терапію і за показаннями противірусну терапію [85].
Відмінними особливостями запропонованої нами методики є застосування при діагностуванні інтраамніального інфікування cпецифічної противірусної (протефлазид) і антибактеріальної терапії (вільпрофен); корекція порушень матково-плацентарного кровообігу (хофітол, каніфрон); нормалізація газообміну в системі "мати-плацента-плід" та покращення процесів метаболізму в плаценті (коензим-композітум, гепар-композітум); неспецифічна імунокорекція (енгістол, віферон, інтерферон) і нормалізація мікробіоценозу статевих шляхів (тержинан, біфідумбактерин, лактобактерин). Наступний курс використовували під контролем клініко-функціональних і лабораторних методів дослідження.
2.2. Методи дослідження
Для діагностики вірусної інфекції (ЦМВ і РГІ) використо-вували метод імуноферментного аналізу (ІФА), полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та імунофлюоресцентної мікроскопії. Матеріалом для дослідження служили: венозна кров, слиз цервікального каналу, сеча та слина.
У якості лабораторної діагностики ЦМВ і РГІ використовували експрес метод з імуноферметною тест-системою та серологічні методи, які засновані на виявленні антигенів вірусу простого герпесу [52]. Дослідження по виявленню віруспецифічних антитіл у зразках сироваток здійснювали ІФА-тест-системою по виявленню антитіл до ЦМВ; ВПГ - 1 і ВПГ - 2. Постановку тесту здійснювали в 3 паралельних рядах, де один з них був сорбованим у лунках антигеном ЦМВ; ВПГ - 1 типу, по 2 ряду - антигеном ВПГ - 2 типу. Для контролю використовували клітинний субстрат, на якому вирощували вірус. Сироватки кожної пацієнтки дослід-жували в 3-разовому розчиненні, починаючи з розведення 1:100. Комплекс антиген-антитіло визначали за допомогою пероксидазного кон'югату проти глобулінів людини (Росія). Для виявлення вірусного антигену в якості антитіл для створення імуносорбенту використовували суміш АТ до ЦМВ; вірусу герпеса 1 та 2 серотипів. Дана модифікація дозволила з однаковою ефективністю уловлювати різні типи вірусу герпеса. У якості антитіл використовували такі ж антитіла, мічені пероксидазою. Облік здійснювали на спектрофотометрі при довжині хвилі 492 нм. ІФА дозволив визначити та, що особ-ливо важливо, розмежувати специфічні антитіла класу Ig G (реконвалісцентні або анамнестичні) та Ig ("гострі"), що відповідають свіжому зараженню або рецидиву хронічної РГІ, виявити вірусні антигени (ВГГ та ЦМВ) у сечі, слині та слизу цервікального каналу. До переваг даного методу відносять високу чутливість, специфічність, швидкість та простоту виконання.
Діагностика ЦМВ та герпес-вірусної інфекції була здійснена на молекулярно-генетичному рівні методом ПЦР [52]. У основі реакції лежить ампліфікація in vitro, де використовуються дві олігонуклеотидних праймера (приманки), фланкіруючі ділянку ДНК специфічної для визначення збудника, процес ампліфікації полягає в циклах температурної денатурації ДНК, що повторюються, випалу праймерів з компліментарними послідовностями та наступною добудовою полінуклеотидних ланцюгів цієї ділянки ДНК з цих праймерів ДНК-полімерази. У результаті відбувається експоненціальне збільшення кількості специфічного фрагмента по формулі 2n, де n - це число минулих циклів ампліфікації. Надалі проводять електрофотометричний аналіз продуктів ПЦР в агарозному гелі. Обов'язково ставлять позитивний контроль із явно внесеною детектируємою нуклеїновою кислотою і негативний контроль. Пофарбовану етидум бромідом ДНК у гелі переглядають під УФО - випромінюванням при довжині хвилі 254 нм, по наявності специфічного фрагменті ампліфікації судять про присутність шуканої нуклеїнової кислоти в досліджуваному матеріалі. Метод ПЦР відноситься до високочутливої діагностики, він специфічний і час виконання складає декілька часів.
Мікроскопічна діагностика вірусної інфекції передбачала дослідження матеріалу, пофарбованого імуноглобулінами, що люмінісцюють, проти ЦМВ та вірусу простого герпеса типу 1 та 2 методом прямої імунофлюоресценції. Матеріалом для дослідження стали зскрібки епітелію в області заднього склепіння піхви, піхвової частини шийки матки та цервікального каналу. При наявності уражень шкіри в області вульви та промежини для дослідження проводилися мазки - відбитки з поверхні підозрілих на вірусне ураження ділянок. Діагностичну ефективність бактеріоскопічного методу оцінювали відносно до результатів мікроскопічного дослідження.
Відбір проб для мікробіологічного дослідження здійснювали з використанням правил асептики та